Методические рекомендации "Криминалистическое исследование опийного и масличного маков" (утв. Постоянным комитетом по контролю наркотиков 18 августа 1994 г., протокол N 32)
По состоянию на 25 сентября 2006 года
Методика экспертного исследования
Принцип химической диагностики снотворного мака основан на обнаружении с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле алкалоидов наркотолина, наркотина и ретикулина:
- при наличии наркотолина либо при полном отсутствии наркотина и наркотолина образец относят к маку масличному;
- при наличии значительного количества наркотина (более 15 - 20% от морфина) и полном отсутствии наркотолина образец относят к маку опийному;
- при наличии ретикулина образец относят к украинским сортам масличного мака. (Этот признак используется в качестве дополнительного.)
Для обнаружения наркотолина, ретикулина и других фенольных алкалоидов мака снотворного авторами разработан способ проявления хроматографических пластинок раствором стабилизированной соли диазония - прочного синего Б, ранее применявшийся только для обнаружения каннабиноидов. Этот способ существенно повышает чувствительность и селективность анализа и в сочетании с реактивом Драгендорфа позволяет однозначно идентифицировать наркотолин и ретикулин без применения эталонных веществ.
Правомочность применения предлагаемого принципа химической диагностики и его методического решения подтверждена в процессе серийной оценки образцов мировой коллекции мака, а также местных форм из различных районов страны.
Предлагаемая методика анализа образцов мака состоит из этапов: экстракции алкалоидов хлороформом, количественного (или полуколичественного) определения морфина любым общепринятым методом и последующего обнаружения сопутствующих морфину алкалоидов (наркотолина, наркотина, ретикулина) с помощью тонкослойной хроматографии.
Перед началом исследования необходимо выяснить, относится ли представленное на исследование растение к маку снотворному. Для этого методом тонкослойной хроматографии определяют наличие в исследуемом объекте морфина, кодеина, тебаина. Наличие этого комплекса признаков позволяет отнести растение к маку снотворному.
Подготовка проб для анализа. Исследуемый объект измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Влажную солому мака предварительно высушивают в сушильном шкафу (желательно с принудительной вентиляцией) при температуре 50 - 60°С.
Затем 2 г измельченной растительной массы помещают в коническую колбу вместимостью 200 мл с пришлифованной пробкой, приливают 5,0 мл 5% раствора карбоната калия, тщательно перемешивают до равномерного увлажнения и оставляют на 15 мин для набухания, после чего приливают 100 мл хлороформа, колбу закрывают пробкой и в течение 30 мин встряхивают на качалке или перемешивают магнитной мешалкой. Прилипшие к стенкам колбы растительные частицы периодически погружают в раствор стеклянной палочкой с плоским концом. Полученный экстракт фильтруют через небольшой ватный фильтр в плоскодонную колбу. Первые 3 - 4 мл фильтрата отбрасывают. Порцию фильтрата объемом 20 мл, что соответствует 0,4 г сырья, переносят в маленькую круглодонную колбу и отгоняют растворитель досуха с вакуумом при температуре водяной бани 45 - 50°С. Эту пробу используют для проведения дифференциации: 40 мл фильтрата используют для количественного определения морфина.
Методика определения. Перед началом определения необходимо установить содержание морфина в растительном сырье. Для этого можно применять любой из известных методов: газохроматографический, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, метод полуколичественного определения морфина. С этой целью две порции хлороформного экстракта из соломы мака объемом по 10 мл (что соответствует 0,2 г сырья) помещают в круглодонные колбы и отгоняют растворитель досуха. Сухой остаток в одной колбе растворяют в 5 мл метанола (хлороформа), во второй - в 2,5 мл.
На стартовую линию пластинки размером 10 х 10 см с нейтральным слоем силикагеля наносят приготовленные растворы в количествах, указанных в табл.1. Диаметр пятен на старте при нанесении не должен превышать 3 мм. Для каждого разведения наносят не менее двух серий пятен. После полного высыхания пятен пластинку хроматографируют в смеси растворителей толуол-ацетон-этанол-аммиак (25%) (45:45:6:2), затем высушивают под тягой в течение 30 - 40 мин до полного исчезновения запаха аммиака. Пластинку опрыскивают реактивом Драгендорфа и отмечают минимальные объемы нанесенных на пластинку проб, при которых четко проявляются пятна морфина. По табл.1 находят соответствующее содержание морфина в образце (в процентах).
Таблица 1
Содержание морфина в растительном сырье в зависимости от объема нанесенного экстракта
------------------------------------T-----------------------------------¬ ¦ Количество раствора на пластинке, ¦ Содержание морфина в сырье, % ¦ ¦ мкл ¦ ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦Разведение 5 мл ¦ ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 2,5 ¦ 1,00 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 3,0 ¦ 0,80 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 3,5 ¦ 0,70 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 4,0 ¦ 0,60 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 4,5 ¦ 0,55 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 5,0 ¦ 0,50 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦Разведение 2,5 мл ¦ ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 2,5 ¦ 0,50 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 3,0 ¦ 0,40 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 3,5 ¦ 0,35 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 4,0 ¦ 0,30 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 5,0 ¦ 0,25 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 6,0 ¦ 0,20 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 8,0 ¦ 0,15 ¦ +-----------------------------------+-----------------------------------+ ¦ 12,0 ¦ 0,10 ¦ L-----------------------------------+------------------------------------
Если при различном разведении пробы или разных повторностях на пластинках будут получены разные показатели содержания морфина в образце, результаты усредняют.
После получении показателей содержания морфина пробу, предназначенную для обнаружения наркотина, наркотолина и ретикулина, растворяют в различных объемах смеси метанола с хлоформом (3:1) в либо чистом хлороформе. Объем растворителя выбирается в зависимости от содержания морфина в испытуемом образце (табл.2). Полученные растворы наносят на пластинки в количестве, указанном в той же таблице.
Таблица 2
Объем пробы, необходимой для нанесения на хроматографическую пластину, в зависимости от содержания морфина в растительном сырье
-------------T----------------------------------------------------------¬ ¦ Содержание ¦ Объем ¦ ¦ морфина в +-----------------------------T----------------------------+ ¦ образце, % ¦ для растворения сухого ¦для нанесения на пластинку, ¦ ¦ ¦ остатка, мл ¦ мкл ¦ ¦ +---------------T-------------+---------------T------------+ ¦ ¦ наркотолин, ¦ ретикулин ¦ наркотолин, ¦ ретикулин ¦ ¦ ¦ наркотин ¦ ¦ наркотин ¦ ¦ +------------+---------------+-------------+---------------+------------+ ¦0,1 ¦ 1,0 ¦ 0,5 ¦ 8,8 ¦ 12,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,15 ¦ ¦ ¦ 5,8 ¦ 9,0 ¦ +------------+---------------+-------------+---------------+------------+ ¦0,20 ¦ 2,0 ¦ 1,0 ¦ 8,8 ¦ 12,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,25 ¦ ¦ ¦ 7,0 ¦ 10,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,30 ¦ ¦ ¦ 5,8 ¦ 9,0 ¦ +------------+---------------+-------------+---------------+------------+ ¦0,35 ¦ 4,0 ¦ 2,0 ¦ 10,0 ¦ 15,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,40 ¦ ¦ ¦ 8,8 ¦ 12,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,45 ¦ ¦ ¦ 7,8 ¦ 11,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,50 ¦ ¦ ¦ 7,7 ¦ 11,0 ¦ +------------+---------------+-------------+---------------+------------+ ¦0,55 ¦ 6,0 ¦ 3,0 ¦ 9,6 ¦ 15,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,60 ¦ ¦ ¦ 8,8 ¦ 12,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,65 ¦ ¦ ¦ 8,1 ¦ 12,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,70 ¦ ¦ ¦ 7,5 ¦ 11,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,75 ¦ ¦ ¦ 7,0 ¦ 10,5 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦0,80 ¦ ¦ ¦ 6,0 ¦ 9,0 ¦ L------------+---------------+-------------+---------------+-------------
Объем пробы и разведение выбраны с таким расчетом, чтобы наркотин проявлялся только при содержании более 20% от морфина.
Для обнаружения наркотолина и наркотина на стартовую линию хроматографической пластинки с нейтральным слоем силикагеля наносят три порции исследуемого извлечения, а также 0,01 мл раствора стандартных образцов алкалоидов, как указано на схеме (рис.1).
--------T-------T--------¬
¦ 0 0 ¦ 6
¦ ¦ ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ 5
¦ ¦ ¦ ¦
¦ 0 0 0 ¦ 4
¦ ¦ ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ 3
¦ ¦ ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ 2
¦ ¦ ¦ ¦
¦ 0 0 0 0 0 0 ¦ 1
¦ ¦ ¦ ¦
+-0-----T-0-----T-0------+
¦ а б в г д е ¦
L-------+-------+---------
Рис. 1. Хроматограмма экстракта маковой соломы
Система толуол-ацетон-этанол-аммиак (25%) (45:45:6:2).
Пластинки многоразовые полимерные "Сорбил" или стеклянные производства различных фирм: 1 - морфин, 2 - кодеин, 3 - тебаин, 4 - наркотолин, 5 - папаверин, 6 - наркотин; а, в, д - испытуемые растворы; б, г, е - растворы стандартных образцов.
Пятна подсушивают в токе холодного воздуха, после чего пластинку хроматографируют восходящим способом в системе растворителей толуол-ацетон-этанол-аммиак (25%) (45:45:6:2). После прохождения фронта растворителя до конца пластинки ее сушат под тягой в течение 20 мин, закрывают стеклом зону "д-е", а оставшуюся часть опрыскивают свежеприготовленным 0,1% водным раствором прочного синего Б. Все проявленные пятна обводят карандашом и немедленно записывают их окраску. Через 15 мин отмечают возможные изменения окраски пятен, закрывают стеклом зону "а-б", зону "д-е" открывают и опрыскивают пластинку концентрированным реактивом Драгендорфа. Все проявленные пятна обводят карандашом и фиксируют изменение окраски пятен ранее обнаруженных веществ. На хроматограммах "а" и "в" могут проявиться пятна наркотолина с величиной R_f, около 0,64. Окраска наркотолина с прочным синим Б вначале фиолетовая, а после проявления реактивом Драгендорфа - синяя. Остальные пятна на хроматограмме "в" после проявления реактивом Драгендорфа сливаются с фоном. На хроматограмме "д" небольшое пятно наркотолина располагается непосредственно под пятном папаверина. Наличие четкого пятна наркотолина позволяет отнести объект к масличному маку.
Если наркотолин в образце не найден, то отмечают присутствие наркотина. Если наркотин в пробе не обнаружен, объект относят к масличному маку
При четком обнаружении наркотина и полном отсутствии наркотолина образец относят к опийному маку.
Обнаружение ретикулина (проводится для отнесения образца к украинским сортам мака масличного, если в этом есть необходимость).
На пластинку с нейтральным слоем сорбента наносят две порции извлечения, пятна подсушивают в токе холодного воздуха, а затем хромотографируют в системе хлороформ-изопропанол-аммиак (25%) (30:10:0,8). После окончания хроматографирования пластинку сушат в течение 30 мин, хроматограммы зоны "а-б" закрывают стеклом и опрыскивают 0,5% спиртовым раствором едкого натра, а затем 0,1% спиртовым раствором прочного синего Б. Затем стеклом закрывают хроматограммы зоны "в-г", хроматограммы зоны "а-б" открывают и опрыскивают пластинку реактивом Драгендорфа. Зона ретикулина располагается между зонами морфина и кодеина. Остальные алкалоиды выходят выше кодеина (рис.2).
----------------------¬
¦ 0 0 ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ }4
¦ 0 ¦ ¦
¦ 0 ¦
¦ ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ 3
¦ ¦ ¦
¦ 0 0 ¦ 2
¦ ¦ ¦
¦ 0 0 0 0 ¦ 1
¦ ¦ ¦
+--0-------T--0-------+
¦ а б в г ¦
L----------+-----------
Рис.2. Хроматограмма экстракта маковой соломы
Система хлороформ-изопропанол-аммиак (25%) (30:10:0,8). Пластинки многоразовые, стеклянные производства различных фирм: 1 - морфин, 2 - ретикулин, 3 - кодеин, 4 - остальные алкалоиды опия; а, в - испытуемые растворы; б, г - растворы стандартных образцов.
Следует отметить, что для хроматографирования согласно вышеизложенной методике должны применяться пластины, не содержащие в качестве связующего крахмал, т.е. не темнеющие при опрыскивании реактивом Драгендорфа. Этим условиям отвечают стеклянные пластины, производимые в Эстонии, пластины Merck 60 и 25 и отечественные пластинки "Сорбфил" на стеклянной или полимерной основе.
Оценка результатов исследования и формирование выводов
С целью полного расследования и правильной квалификации правонарушений, связанных с посевом и выращиванием наркотикосодержащих растений, на разрешение экспертизы ставится вопрос: к какому виду относится произраставшее на участке (указывается место изъятия) растение и является ли оно наркотикосодержащим?
Для полного ответа на вопрос в отношении растений рода мак необходимо выявить анатомо-морфологические признаки растения мак (наличие и особенности стебля, листьев, коробочек, наружную и внутреннюю эпидерму, части сосудисто-проводящей системы, млечники, пыльцевые зерна и т.п.), наличие основных алкалоидов опия: морфина, кодеина и тебаина (содержание морфина и кодеина превалирует над содержанием тебаина). На этом этапе эксперт устанавливает принадлежность растений к снотворному маку. Далее необходимо оценить содержание двух алкалоидов - наркотолина и наркотина. При этом возможны три варианта:
- наличие в растительном объекте наркотолина служит достаточным основанием для вывода: представленное на исследование растение является маком масличным;
- при отсутствии на хроматограмме зоны наркотолина обращают внимание на зону наркотина: если в растительном объекте наркотин присутствует (при указанных условиях разведения), то делается вывод: представленное на исследование растение является маком опийным;
- при отсутствии на хроматограмме как зоны наркотолина, так и зоны наркотина растение также относят к маку масличному.
Наличие в растительном объекте алкалоида ретикулина является дополнительным признаком принадлежности данного растительного объекта к маку масличному.
Следует иметь в виду также, что сырье, длительно хранившееся во влажном состоянии, может резко отличаться по компонентному составу от сырья, свежесобранного или высушенного в оптимальных условиях. Поэтому растительное сырье, имеющее признаки загнивания (побурение, плесень и т.д.), использовать для проведения исследования нельзя.
Приготовление раствора стандатных образцов алкалоидов
0,05 г морфина-основания, 0,025 г кодеина-основания, 0,01 г папаверина и 0,01 г наркотина растворяют в 25 мл смеси метанола с хлороформом в соотношении 3:1.
Приготовление реактива Драгендорфа
Раствор 1: 0,85 г нитрата висмута основного растворяют в 40 мл воды и 10 мл уксусной кислоты.
Раствор 2: 20 г йодида калия растворяют в 50 мл воды.
Смешивают равные объемы растворов 1 и 2. К 40 мл смеси добавляют 30 мл уксусной кислоты и 100 мл воды.
______________________________
* Разработчики: А.В.Гаевский, E.B.Коваленко (НПО "ВИЛАР"), В.Г.Савенко, Е.П.Семкин, В.И.Сорокин (ЭКЦ МВД РФ)
