Приказ Минздрава СССР от 8 июня 1978 г. N 558 "Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе"
По состоянию на 25 сентября 2006 года
Микробиологическая диагностика туберкулеза занимает важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для выявления заболевания, установления его прогноза, выбора рациональной схемы терапии и оценки ее эффективности.
В целях дальнейшего совершенствования диагностики туберкулеза и унификации клинических лабораторных методов исследования в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений страны:
I. Утверждаю:
1. Перечень унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе (приложение 1).
2. Методические указания по применению унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе (приложение 2).
II. Приказываю:
1. Министрам здравоохранения союзных республик:
а) организовать с 1979 г. проведение лабораторных исследований при туберкулезе в клинико-диагностических лабораториях страны по утвержденным унифицированным методам;
б) обеспечить обучение врачей и лаборантов со средним медицинским образованием на местных базах применению унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе.
2. Главному управлению учебных заведений (тов. Исаков Ю.Ф.) внести изменения в учебные планы и программы циклов специализации и усовершенствования врачей по клинической лабораторной диагностике с учетом применения унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе.
III. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на Главное управление лечебно-профилактической помощи Министерства здравоохранения СССР (тов. Шаткин И.В.).
Министр здравоохранения СССР
Петровский Б.В.
Приложение N 1 к приказу Минздрава СССР от 8 июня 1978 г. N 558
Перечень
унифицированных микробиологических методов исследования при туберкулезе
1. Сбор патологического материала
1.1. Мокрота
1.2. Промывные воды бронхов
1.3. Промывные воды желудка
1.4. Моча
1.5. Пунктаты из закрытых полостей
1.6. Гной из свищей, отделяемое ран, менструальная кровь и
отделяемое открытых полостей
2. Методы выявления микобактерий туберкулеза
2.1. Бактериоскопические методы
2.1.1. Прямая бактериоскопия мазка с окраской по
Цилю-Нильсену
2.1.2. Бактериоскопия мазка после флотации с окраской по
Цилю-Нильсену
2.1.3. Бактериоскопия мазка с окраской люминесцентными
красителями:
а) по Адамчику,
б) аурамином и родамином
2.2. Культуральный метод
2.2.1. Обработка патологического материала при посеве на
плотную питательную среду
2.2.2. Питательные среды
2.3. Биологический метод
3. Дифференциация выделенных культур микобактерий
3.1. Культуральный метод. Характеристика микобактерий
3.2. Культуральные тесты
3.2.1. Рост на среде с салициловокислым натрием
3.2.2. Рост на среде с паранитробензойной кислотой
3.2.3. Рост на среде с тибоном
3.2.4. Рост на среде с 5% хлористым натрием
3.3. Биохимические методы
3.3.1. Ниациновый тест
3.3.2. Определение амидазной активности
3.3.3. Определение формамидазной активности
3.3.4. Определение нитратредуктазной активности
3.3.5. Определение каталазной и пероксидазной активности
3.3.6. Определение активности термостабильной каталазы
3.3.7. Реакция гидролиза твина-80
3.4. Биологический метод
4. Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к
противотуберкулезным препаратам
4.1. Критерии чувствительности
4.2. Метод абсолютных концентраций на плотных средах
4.3. Определение чувствительности микобактерий туберкулеза к
нескольким противотуберкулезным препаратам
4.4. Определение концентрации туберкулостатических препаратов в
крови больных туберкулезом
4.4.1. Методом серийных разведений в жидкой среде
4.4.2. Определение концентрации стрептомицина в крови
больных методом диффузии в агар
4.5. Туберкулостатическая проба
Заместитель Начальника
Главного управления лечпрофпомощи
Минздрава СССР
Л.Ф.Швецова
Приложение N 2 к приказу Минздрава СССР от 8 июня 1978 г. N 558
Методические указания
по применению унифицированных микробиологических методов
исследования при туберкулезе*
В настоящее время, в условиях широкого применения разнообразных противотуберкулезных препаратов, изменилась биология возбудителя туберкулеза. Изменения касаются как морфологии микобактерий, так и их ферментативной активности и биологических свойств. В связи с этим значительно усложнилась микробиологическая диагностика туберкулеза. Появились также некоторые дополнительные трудности, связанные с выделением в ряде случаев из патологического материала больных атипичных микобактерий, диагностика которых возможна только с применением комплексного исследования, включающего микробиологические, биохимические и биологические методы. Такое комплексное разностороннее исследование возможно в крупных хорошо оснащенных бактериологических лабораториях с высококвалифицированным персоналом. За последние годы в ряде областей и республик созданы центральные лаборатории, выполняющие все виды микробиологических исследований.
Центральные бактериологические лаборатории являются организационно-методическими центрами, которые осуществляют контроль за качеством всех проводимых исследований в лабораториях области или республики, оказывают им методическую помощь, обеспечивают их питательными средами и т.д.
Объем проводимых исследований зависит от материально-технической оснащенности лаборатории и укомплектования ее медицинскими кадрами.
Центральные лаборатории проводят все виды бактериологических исследований, включающих: 1) бактериоскопию, 2) посев патологического материала на яичную среду, 3) определение чувствительности выросших культур к противотуберкулезным препаратам, 4) их типирование и таксономическую идентификацию, 5) заражение лабораторных животных с целью выявления микобактерий туберкулеза (при наличии вивария).
Остальные лаборатории проводят бактериоскопию исследуемого материала, посев его для выделения чистой культуры микобактерий туберкулеза и определение чувствительности к противотуберкулезным препаратам.
Динамика бактериологического исследования больного
Тщательное бактериологическое обследование больного проводится дифференцированно, в зависимости от формы туберкулезного процесса.
Порядок проведения бактериологических исследований установлен в соответствии с приказом Министерства здравоохранения СССР N 689 от 3 сентября 1973 г.
1. Сбор патологического материала для выявления микобактерий
туберкулеза
1.1. Мокрота. Наиболее часто материалом для выявления микобактерий туберкулеза является мокрота больных с различной легочной патологией. При откашливании больным значительного количества мокроты следует использовать для анализа утреннюю порцию мокроты, собранную в тот же день. У больных, выделяющих небольшое количество мокроты, ее следует собирать в течение суток при условии, что собранная в течение дня мокрота будет храниться в холодном месте при температуре не выше +4°С, а затем вместе с утренней порцией будет доставлена в лабораторию.
Обнаружение микобактерий в мокроте при бактериоскопии или методом посева зависит от правильности ее сбора; поэтому больному следует объяснить, как собирать мокроту, чтобы на исследование попало отделяемое из верхних дыхательных путей, а не носоглоточная слизь. Следует почистить зубы, пополоскать рот и откашлять содержимое верхних дыхательных путей в стерильную плевательницу.
Если у больного мокрота выделяется эпизодически в небольшом количестве, то следует накануне и утром дать отхаркивающее или применить метод раздражающей аэрозольной ингаляций, провоцирующей усиление секреции бронхов. В качестве ингалируемой смеси рекомендуется 15% раствор хлористого натрия в 1% растворе двууглекислого натрия (150 г хлористого натрия и 10 г двууглекислого натрия на 1 л дистиллированной воды). Применение раздражающей ингаляции повышает процент выделения микобактерий туберкулеза. (Подробное описание проведения ингаляции приведено в методическом письме "Использование провоцирующих отделение мокроты аэрозольных ингаляций для получения диагностического материала от больных туберкулезом легких").
Собранная мокрота в специальных плевательницах с завинчивающимися крышками доставляется в бактериологическую лабораторию.
Консервирование мокроты. В условиях Средней Азии и некоторых республик с жарким климатом, а также там, где мокроту приходится транспортировать на далекие расстояния, ее необходимо консервировать.
Применяют различные консерванты: глицерин, трехзамещенный фосфорнокислый натрий, 2-3% борную кислоту. Последний консервант наиболее удобен в республиках с жарким климатом.
Мокроту, собранную в стеклянную плевательницу или в специальную двойную пластмассовую коробочку, заливают консервантом в соотношении 1:1, герметически закрывают крышкой, устанавливают в деревянный ящик с гнездами и пересылают вместе с направлением, в котором указаны фамилия больного и адрес, в бактериологическую лабораторию.
1.2. Промывные воды бронхов. При отсутствии у больных мокроты исследуют промывные воды бронхов или желудка. Промывные воды бронхов являются материалом, из которого значительно чаще, чем из промывных вод желудка, высеваются микобактерии туберкулеза при легочных процессах. Однако, промывание бронхов проводится врачом-отоларингологом, поэтому эта процедура доступна только в тех лечебных учреждениях, где имеется такой специалист.
Больному несколько раз во время вдоха вводят шприцем в трахею 5-7 мл стерильного физиологического раствора, который вызывает кашлевой рефлекс. При этом вместе с физиологическим раствором откашливается секрет из глубоких отделов бронхиального дерева. Промывные воды бронхов собирают в стерильную плевательницу и тут же направляют в бактериологическую лабораторию.
У больных с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру производят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки 10% раствором новокаина.
1.3. Промывные воды желудка. Другим распространенным методом получения диагностического материала от больных, не выделяющих мокроту, является промывание желудка. Наиболее широко этот метод применяется в клинике детского туберкулеза.
Микобактерии туберкулеза попадают в желудок при заглатывании небольших количеств мокроты, не отхаркиваемой больными. Промывные воды желудка берут натощак. Последний прием пищи больным должен быть не менее, чем за 12 часов до взятия промывных вод желудка. Для получения промывных вод желудка больному дают выпить стакан (200 мл) дистиллированной воды, так как в сырой воде могут содержаться кислотоустойчивые сапрофиты. После этого вводят желудочный зонд и собирают содержимое желудка в стерильную склянку. Промывные воды желудка исследуют методом флотации или посевом. Для посева можно использовать и флотационное кольцо, и осадок, полученный при центрифугировании. Материал доставляют в лабораторию немедленно.
1.4. Моча. Для исследования мочи используют утреннюю порцию, полученную после тщательного туалета наружных половых органов. Полученную мочу центрифугируют. Если в осадке мочи патологических элементов нет, то для исследования на туберкулез используют суточную порцию мочи, повторяя исследование 2-3 дня подряд.
1.5. Пунктаты из закрытых полостей (спинномозговая жидкость, экссудаты и транссудаты из плевральной и брюшной полостей, гной из натечников и т.п.) берут стерильным шприцем в стерильную посуду и сразу доставляют в лабораторию. В стерильной посуде немедленно доставляют в бактериологическую лабораторию ткань, полученную путем биопсии или во время операции.
1.6. Гной из свищей, отделяемое ран, менструальная кровь и отделяемое открытых полостей берут стерильным шприцем или стерильным ватным тампоном в стерильную посуду и доставляют в лабораторию немедленно.
2. Методы выявления микобактерий туберкулеза
В лабораторной практике основными методами выявления микобактерий туберкулеза являются: бактериоскопический, культуральный методы и биологическая проба. При необходимости проведения бактериоскопии и культурального метода они проводятся одномоментно.
2.1. Бактериоскопические методы выявления микобактерий туберкулеза
Бактериоскопический метод исследования остается одним из основных. Преимущество этого метода - в его быстроте. Однако, возможности его ограничены: известно, что при прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены только при очень большом их количестве - 100.000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала и более. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в значительно меньшем количестве, тогда этот метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления. В таких случаях применяют методы "обогащения" или "накопления" туберкулезных палочек. Наиболее распространенным является метод флотации, при котором микобактерии туберкулеза извлекаются из водной суспензии исследуемого материала с помощью углеводородов, но он требует большой затраты времени.
В последние годы широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения микобактерий, простота флюорохромирования делает его широко доступным для практических лабораторий. Преимущество метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что она позволяет проводить исследование при меньших увеличениях микроскопа и, следовательно, просматривать в короткий срок значительно больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой. Применяя малые увеличения, удается быстрее и в большем количестве выявить микобактерии туберкулеза. Люминесцентная микроскопия позволяет увеличить процент находок на 8% по сравнению с методом флотации и на 17% по сравнению с прямой бактерископией мазка. Этот метод, кроме того, - наиболее экономичный из всех бактериоскопических методов исследования и рекомендуется как основной метод, который в ближайшее время должен заменить бактериоскопию по Цилю-Нильсену и флотацию.
2.1.1. Прямая бактериоскопия мазка с окраской по Цилю-Нильсену
Принцип метода основан на способности микобактерий туберкулеза после окрашивания их фуксином удерживать краситель даже после длительного обесцвечивания в серной кислоте или в солянокислом спирте.
Реактивы.
1. 1% раствор основного фуксина: 1 г основного фуксина растирают с 2-3 каплями глицерина, добавляют по капле 10 мл 96° этилового спирта и 90 мл 5% раствора фенола. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют через бумажный фильтр. Хранят в темном месте при комнатной температуре в хорошо закрытой посуде.
2. 5% раствор фенола (карболовой кислоты).
3. 20% серная кислота.
4. Этиловый спирт 96°.
5. Соляная кислота концентрированная.
6. 0,025% раствор метиленового синего: 0,25 г метиленового синего на 1 л дистиллированной воды.
7. 3% солянокислый спирт: 3 мл концентрированной соляной кислоты доводят до 100 мл этиловым спиртом.
8. Глицерин.
9. Фильтровальная бумага.
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Газовая или спиртовая горелки.
Предметные стекла.
Ход исследования.
Приготовление мазка. Мокроту выливают в чашку Петри. Двумя препаровальными иглами или деревянными хорошо заостренными палочками выбирают из 3-4-х различных мест гнойные комочки и переносят их на обезжиренное спиртом стекло. Другим стеклом растирают мокроту. Получают 2 препарата-близнеца. Мазок должен быть тонким и занимать 3/4 стекла. Затем препарат фиксируют над пламенем горелки и окрашивают. В целях большей безопасности мазки из мокроты можно делать из осадка после обработки материала.
Промывные воды бронхов, желудка, мочу, пунктаты из закрытых полостей (кроме стерильно взятого ликвора) обрабатывают кислотой или щелочью, центрифугируют и из осадка готовят препараты, которые затем окрашивают. Мазки из гноя, отделяемого ран и т.п. материала готовят путем растирания его между стеклами. Препарат фиксируют над пламенем горелки и окрашивают.
Мазки из различного патологического материала рекомендуется делать под вытяжным шкафом.
Окрашивание мазка. На фиксированный препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, размером немного меньше предметного стекла, но так, чтобы она закрыла мазок полностью. Наливают на нее раствор карболового фуксина и нагревают препарат над пламенем горелки до появления паров. Пинцетом снимают фильтровальную бумагу и смывают остатки краски водой. Мазок обесцвечивают в 20% серной кислоте или в 3% солянокислом спирте до слегка розовато-сероватого цвета и тщательно промывают водой. Обесцвеченный мазок докрашивают в течение 30 секунд 0,025% раствором метиленового синего. В результате микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы - в голубой.
Оценка результатов. Препарат микроскопируют с иммерсией. На просмотр препарата обычно требуется около 5 минут. Этого времени достаточно, чтобы обнаружить единичные микобактерии в препарате. В этом случае необходимо просмотреть не менее 100 полей зрения. При бактериоскопии мочи следует иметь в виду, что в моче могут быть палочки смегмы, которые по морфологии легко спутать с микобактериями туберкулеза.
В мазках из промывных вод бронхов и желудка, а также в мазках мочи могут быть кислотоустойчивые сапрофиты; поэтому в сомнительных случаях рекомендуется подвергнуть мазок длительному обесцвечиванию (45-60 минут) в 3% солянокислом спирте или в жавелевой воде. При таком методе обесцвечивания сапрофиты теряют свою окраску и выглядят в виде палочек голубого цвета. Отличить бактериоскопически микобактерии туберкулеза от кислотоупорных сапрофитов трудно, так как в связи с химиотерапией противотуберкулезными препаратами резко изменилась морфология возбудителя туберкулеза. Часто, наряду с тонкими, встречаются грубоватые, "с обрубленными концами" микобактерии, окрашенные в более темный цвет.
При антибактериальной терапии выделение микобактерий туберкулеза имеет прогностическое значение. Поэтому количество микобактерий в препарате рекомендуется оценивать как обильное, умеренное и скудное.
Количество микобактерий в мазке (или колоний в пробирке при культуральном методе исследования) в процессе химиотерапии является ориентировочным показателем ее эффективности или косвенным свидетельством развития устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам: если в процессе химиотерапии количество микобактерий в препарате не уменьшается по сравнению с первоначальным - терапию больного следует изменить.
После длительной химиотерапии в материале могут встречаться нежизнеспособные микобактерии. Поэтому для обнаружения жизнеспособных микобактерий делают посев исследуемого патологического материала на яичную среду.
2.1.2. Бактериоскопия мазка с окраской по Цилю-Нильсену после флотации
Принцип. Микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, при встряхивании водной суспензии этого материала с углеводородом прилипают к капелькам углеводорода и удерживаются на их поверхности. Капельки углеводорода, будучи легче воды, всплывают, образуя пену, в которой концентрируются микобактерии туберкулеза.
Реактивы.
1-9. Те же, что и в методе прямой бактериоскопии мазка по Цилю-Нильсену.
10. 0,5% раствор едкого натра или едкого кали.
11. Бензин или бензол, ксилол, толуол.
Специальное оборудование.
То же, что и в методе прямой бактериоскопии по Цилю-Нильсену.
Водяная баня, покрытая большим стеклом.
Бутылка емкостью 250 мл.
Аппарат для встряхивания.
Ход исследования. 10-15 мл мокроты помещают в бутылку емкостью 250 мл и добавляют примерно равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали. Бутылку закрывают плотной пробкой, обернутой вощеной бумагой, и в течение 5-10 минут тщательно встряхивают в аппарате для встряхивания или ручным способом. Мокрота при этом гомогенизируется. К гомогенизированной мокроте добавляют примерно 100 мл дистиллированной воды, и 0,5 мл углеводорода (ксилола, бензина, бензола или толуола), удельный вес которого меньше удельного веса воды. Все содержимое бутылки снова тщательно встряхивают в течение 5-10 минут, затем доливают дистиллированной водой до горлышка бутылки. Дистиллированная вода, применяемая для этого метода, должна быть свежеперегнанной. Пользоваться водопроводной водой, даже кипяченой, не рекомендуется.
Через 30 минут после добавления воды на поверхности образуется сливкообразное кольцо, состоящее из капелек углеводорода с захваченными микобактериями.
При исследовании этим методом промывных вод бронхов или желудка, экссудатов, спинномозговой жидкости и гноя к полученной жидкости добавляют 1-2 мл 0,5% водного раствора едкого натра или едкого кали и в дальнейшем поступают так же, как при исследовании мокроты. Мочу отстаивают в течение суток, затем верхний слой сливают, а осадок флотируют.
Приготовление мазков. Препараты готовят из флотационного кольца. Предметные стекла заранее раскладывают на большое стекло, покрывающее хорошо нагретую водяную баню или кастрюлю (между стеклом и кастрюлей делают резиновую прокладку). Пастеровской пипеткой с баллоном отсасывают часть образовавшегося кольца и наносят на предметное стекло, занимая примерно 1/3 площади.
На подсохший мазок вновь наносят той же пипеткой несколько капель флотационного кольца. Такое наслаивание по принципу толстой капли на одно и то же место производят 3-4 раза, причем каждую каплю высушивают, прежде чем нанести следующую. Мазки оставляют до полного высыхания на подогретом стекле, покрывающем водяную баню, после чего фиксируют их над пламенем горелки.
Окрашивание мазков. Фиксированный препарат окрашивается и обесцвечивается, как это описано в методе прямой бактериоскопии мазков по Цилю-Нильсену.
Оценка результатов. Такая же, как в методе прямой бактериоскопии мазков по Цилю-Нильсену.
Этот метод позволяет обнаружить микобактерии туберкулеза в патологическом материале чаще, чем прямая бактериоскопия при окраске по Цилю-Нильсену. Метод флотации может быть применен для исследования мокроты, промывных вод бронхов и желудка, спинно-мозговой жидкости, мочи, экссудатов, гноя и т.п. Однако, этот метод требует значительной затраты времени и может быть с успехом заменен люминесцентной микроскопией, в которой наиболее употребительны две окраски: акридиновым оранжевым и аурамином с родамином.
2.1.3.(а) Бактериоскопия мазка с окраской люминесцентными
красителями (по Адамчику)
Принцип. Метод основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерии туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты.
Реактивы.
1. Акридиновый оранжевый.
2. 3% солянокислый спирт.
3. Метиловый спирт.
4. 10% раствор аммиака.
Основной раствор акридиного оранжевого: 1 г красителя + 100 мл дистиллированной воды.
Рабочий раствор акридинового оранжевого: 10 мл основного раствора красителя +990 мл дистиллированной воды. Добавляют 3-5 капель 10% раствора аммиака; pH должен быть не меньше 9,0.
Специальное оборудование.
Люминесцентный микроскоп.
Ход исследования. Приготовление мазков. Мазки готовят из осадка, полученного при обработке материала для посева, нанося на стекло одну каплю. Можно готовить препарат обычным способом, а не из осадка. Препараты фиксируют метиловым спиртом 3-5 минут. Стекла должны быть тонкими и без царапин.
Окрашивание мазков. Окраску рабочим раствором акридинового оранжевого производят в течение 24 часов без подогрева. Рекомендуется погрузить мазки в ванночку с раствором красителя, чтобы не допустить высыхания препаратов. Мазки обесцвечивают дважды по 10 минут 3% солянокислым спиртом, а затем промывают дистиллированной водой и сушат в термостате. Хранят препараты в темном месте.
Оценка результатов. Препарат просматривают без иммерсии с объективом x40 и окуляром x10. Количество микобактерий оценивается так же, как в методе прямой бактериоскопии мазка по Цилю-Нильсену. Положительный ответ дают при обнаружении не менее 3-х микобактерий в препарате.
2.1.3.(б) Бактериоскопия мазка с окраской люминесцентными
красителями (аурамином, родамином)
Принцип. Тот же, но этот метод окраски требует меньше времени.
Реактивы.
1. Аурамин 00.
2. Родамин С.
3. 3% солянокислый спирт.
4. 0,25%о водный раствор метиленовой синьки.
Рабочий раствор: аурамина 1 г, родамина 0,1 г, дистиллированой воды 1.000 мл.
Окрашивание мазков. Фиксированный над пламенем горелки мазок окрашивают в течение 10 минут при легком подогревании рабочим раствором смеси аурамина и родамина. После окраски мазок промывают водой, обесцвечивают 3% солянокислым спиртом и снова промывают водой. Гашение фона производят путем окраски 0,25%о раствором метиленовой синьки, после чего мазок промывают водой.
При люминесцентной микроскопии необходимо пользоваться инструкцией для правильного использования осветительной аппаратуры.
Таким образом, для обнаружения микобактерий туберкулеза имеется ряд бактериоскопических методов. Эти методы просты, общедоступны и позволяют получить ответ в максимально короткий срок. Однако, они все же являются менее чувствительными, чем культуральный метод - посев.
2.2. Культуральный метод выявления микобактерий туберкулеза
Культуральный метод выявления микобактерий имеет большие преимущества перед методом бактерископии. Он позволяет выявить микобактерии туберкулеза в исследуемом материале, если их содержится около 100 в 1 мл. Выросшие культуры могут быть подробно исследованы и идентифицированы, у них может быть определена чувствительность к противотуберкулезным препаратам, изучена вирулетность и другие свойства. Выделение микобактерий культуральным методом свидетельствует о высокой жизнеспособности микобактерий и вегетировании их в организме больного.
2.2.1. Обработка патологического материала при посеве на плотную
питательную среду
Бактериологическому исследованию подвергается самый различный материал: мокрота, промывные воды бронхов, желудка, экссудат, отделяемое ран, моча, ликвор, биопсийный и секционный материал и др. Материал должен доставляться в лабораторию в стерильной, хорошо закрытой посуде.
Для обработки патологического материала используют разные вещества. Основные требования, которые предъявляют к таким реактивам, - это, с одной стороны, полное сохранение жизнеспособности микобактерий туберкулеза, а с другой, - подавление роста неспецифической микрофлоры, которая может быть в исследуемом материале. Для практики могут быть рекомендованы следующие методы обработки патологического материала.
Обработка трехзамещенным фосфорнокислым натрием. Этот метод является наиболее удобным и распространенным.
Принцип. Трехзамещенный фосфат натрия является щадящим туберкулезные палочки реактивом. Этот метод щелочной обработки допускает длительную экспозицию патологического материала с фосфатом натрия без нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза даже при длительном хранении материала (2-3 дня). Это особенно ценно в тех случаях, когда доставка материала в лабораторию затруднена. Кроме того, трехзамещенный фосфат натрия хорошо угнетает сопутствующую неспецифическую флору. Обработке трехзамещенным фосфорнокислым натрием подвергают мокроту, промывные воды бронхов, экссудаты и другие материалы.
Реактивы: Nа3РO4 - 10%.
Обработка состоит в добавлении к исследуемому материалу равного по объему количества 10% раствора трехзамещенного фосфата натрия и инкубации этой смеси при 37°С в термостате в течение 24 часов. После инкубации материал центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл среды Школьниковой или физиологического раствора и заседают по 0,5 мл на 3 пробирки яичной среды.
Обработка фосфатом натрия удобна тогда, когда мокроту для посева надо доставлять в лабораторию издалека. В этом случае больной в течение суток собирает мокроту в стерильную плевательницу, в которой имеется 10 мл 10% раствора фосфата натрия. При доставке мокроты в лабораторию содержимое плевательницы переливают в стерильные пробирки, центрифугируют, надосадочную жидкость сливают, а осадок засевают обычным способом.
Обработка щелочью. Принцип метода: щелочь обладает способностью растворять белковые частицы, что способствует быстрой гомогенизации материала, содержащего гной, слизь и т.п., и высвобождению микобактерий туберкулеза из белковых частиц.
Реактивы.
1. Едкий натр (NaOH) - 4%.
2. Соляная кислота (НС1) - 9% и 4%.
3. Бромтимоловый синий - 0,02%.
Приготовление различных концентраций соляной кислоты: 9% р-р - 1 часть 36% HCl + 3 части дистиллированной воды, 4% р-р - 1 часть 36% HCl + 8 частей дистиллированной воды.
В склянку с бусами помещают исследуемый материал, добавляют двойной объем 4% NaOH с 0,02% бромтимолового синего (несколько кафель, до появления слабо-синего окрашивания). Хорошо смешивают и ставят в термостат на 20 минут. На протяжении этого времени несколько раз перемешивают материал с реактивами, добиваясь полной его гомогенизации. Гомогенат нейтрализуют 9% HCl до изменения синей окраски в зелено-желтую. Заключительную стадию нейтрализации производят 4% HCl. После нейтрализации весь материал переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора и засевают на 3 пробирки плотной яичной среды.
Этот метод обработки дает большой выход микобактерий, но несколько больший % пророста, чем обработка трехзамещенным фосфатом натрия. Обработка материала щелочью более громоздка, чем обработка кислотой или трехзамещенным фосфорнокислым натрием, но в практической работе она принята, так как не нужно так тщательно следить за временем, как при обработке кислотой, и можно поэтому одновременно обрабатывать большое количество проб.
Обработка кислотой. Для обработки патологического материала можно пользоваться серной кислотой. Этот метод удобен для обработки материала в тот же день, например, перед выходным днем. В зависимости от загрязненности материала используют кислоту различной концентрации. Мокроту, гнойные экссудаты, тампоны из ран, пунктаты лимфатических узлов, промывные воды желудка, бронхов, операционный материал обрабатывают 3-4%, мочу - 6%, секционный материал - 10% серной кислотой. Стерильно взятую спинномозговую жидкость, серозные экссудаты можно засевать без обработки.
Исследуемый материал помещают в банку с бусами, добавляют равное количество серной кислоты и тщательно, в течение 10 минут встряхивают. Затем обработанный кислотой материал 10 минут центрифугируют. Время контакта материала с кислотой не должно превышать 20 минут от начала обработки. После центрифугирования кислоту сливают, к осадку добавляют физиологический раствор, центрифугируют и сливают, отмывая кислоту. Осадок засевают на яичную среду. При засеве материала петлей осадок можно не отмывать. Следует помнить, что при любом методе обработки промывные воды желудка сеют сразу же, так как желудочный сок губительно действует на микобактерии туберкулеза, и при длительном стоянии часть палочек погибает. Если патологический материал доставлен в большом количестве (промывные воды желудка, моча и т.п.), то вначале его центрифугируют, собирают осадок, который затем обрабатывают и засевают. При всех способах обработки материала посев производят минимум на 3 пробирки яичной среды.
Для повышения выхода микобактерий целесообразно делать посев патологического материала на две яичные среды - на среду Левенштейна-Иенсена и на среду Финна II. Таким образом, для посева используют 4 пробирки: по 2 пробирки каждой среды.
Посевы просматривают каждые 7-10 дней. Рост микобактерий туберкулеза появляется на 3-6 неделе в виде сухих беспигментных R-колоний. После курса химиотерапии от больных могут выделяться культуры с гладким влажным ростом. Положительный ответ дают только после микроскопии выросших культур. Интенсивность роста обозначают по 3-балльной системе:
+ единичные колонии, до 20 (скудное бацилловыделение; бактериоскопически микобактерии не определяются).
++ от 20 до 100 колоний (умеренное бацилловыделение; бактериоскопически определяются единичные микобактерии в каждом поле зрения или единичные - в препарате, но не менее пяти).
+++ более 100 колоний (обильное бацилловыделение: бактериоскопически - 10 и более палочек в каждом поле зрения).
Большинство посевов дает рост микобактерий туберкулеза в течение двух месяцев. Поэтому достаточно инкубировать посевы до двух с половиной месяцев. При отсутствии роста к этому времени посев считается отрицательным, и пробирки удаляют.
2.2.2 Питательные среды
Для посева патологического материала используют следующие яичные среды: Левенштейна-Иенсена, Гельберга, Петраньяни, а в последнее время - среду Финна и Мордовского.
Среда Левенштейна-Иенсена рекомендована Всемирной организацией здравоохранения для всех координационных лабораторий. Этой средой пользуется большинство лабораторий Советского Союза.
Заслуживает внимания среда Финна II. Она отличается от среды Левенштейна-Иенсена тем, что вместо L-аспарагина используется глютамат натрия. На этой среде рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, чем на среде Левенштейна-Иенсена. По данным ряда лабораторий, процент выделения культур из патологического материала - такой же, а по данным лабораторий Ленинградского, Молдавского и Центрального институтов туберкулеза, он на 6-8% выше, чем на среде Левенштейна-Иенсена. Использование двух сред одновременно повышает процент выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала.
Приготовление плотных питательных сред
Среда Левенштейна-Иенсена (без крахмала):
Солевой раствор:
однозамещенный фосфорнокислый калий - 2,4 г
магний сернокислый - 0,24 г
магний лимоннокислый - 0,6 г
L-аспарагин - 3,6 г
глицерин - 12 мл
вода дистиллированная - 600 мл.
Реактивы растворяют в указанной последовательности при слабом подогревании и стерилизуют 2 часа текучим паром.
Солевая основа может быть приготовлена с запасом на 3-4 недели.
Яичная масса: 24-27 (в зависимости от величины) свежих диетических яиц моют проточной теплой водой, щеткой с мылом, погружают на 30 минут в 70% спирт, а затем над спиртовкой в боксе разбивают стерильным пинцетом в колбу с бусами, хорошо размешивают и 1 л яичной массы добавляют к 600 мл солевого раствора. Смесь фильтруют через марлевый фильтр, добавляют 20 мл стерильного 2% раствора малахитовой зелени и разливают в пробирки приблизительно по 5 мл. Свертывание производят при 85°С в течение 45 минут.
Среда Петраньяни:
К 300 мл цельного молока добавляют 12 г картофельной муки, 2 г пептона, 2 клубня, величиной с куриное яйцо, мелко нарезанного картофеля. Все указанные ингредиенты хорошо смешивают, смесь несколько минут подогревают на кипящей водяной бане до образования клейстера, оставляют стоять в водяной бане на час, помешивая. Затем охлаждают до 50°С и добавляют к разбитым в колбе с бусами 8 цельным яйцам и 2 желткам. Добавляют 24 мл глицерина и 10 мл 2% раствора малахитовой зелени. Среду фильтруют через 4-слойный марлевый фильтр, разливают по пробиркам и скашивают в аппарате для свертывания и инактивирования сыворотки при 85-90°С в течение 1 часа.
Среда Финна II:
Солевая основа:
магний сернокислый - 0,5 г
натрий лимоннокислый - 1 г
квасцы железоаммиачные - 0,05 г
калий фосфорнокислый однозамещенный - 20 г
аммоний лимоннокислый однозамещенный - 5 г
натрий глутаминовокислый однозамещенный - 10 г
глицерин - 20 мл
вода дистиллированная - до 1 л.
Ингредиенты растворяют в указанном порядке в теплой дистиллированной воде.
pH (не корригировать) - 6,3-6,5.
Стерилизовать при 1 атмосфере - 20 минут.
Яичная масса: 12 яиц моют щеткой с мылом, обрабатывают спиртом. Разбивают стерильным пинцетом и выливают в стерильную колбу с бусами, которую после добавления каждого яйца встряхивают до образования однородной массы.
Добавляют 10 мл 2% водного раствора малахитовой зелени и 300 мл солевого раствора. Фильтруют через марлевый фильтр и свертывают при температуре 85°С в течение 30 минут.
2.3. Биологический метод исследования
До последнего времени наиболее чувствительным и эффективным способом обнаружения микобактерий туберкулеза считался метод биологической пробы - заражение обработанным материалом чувствительных к туберкулезу животных (морских свинок). Однако, с введением в клиническую практику химиотерапии и появлением форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, биологическая проба, по мнению ряда исследователей, утратила свою эффективность, так как часто микобактерии, устойчивые к химиотерапевтическим препаратам, в частности к ГИНК, авирулентны для морских свинок. Наши исследования олигобациллярного материала показали, что как метод посева, так и биологическая проба дают примерно одинаковый процент (6,8-7,2%) выделения микобактерий из патологического материала.
Для повышения частоты обнаружения в патологическом материале микобактерий туберкулеза многие авторы используют, помимо подкожного заражения, интратестикулярное. При таком методе заражения удается чаще обнаруживать в патологическом материале изониазидоустойчивые слабовирулентные микобактерии.
Заражение морских свинок следует проводить в диагностических случаях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания у нелеченных больных, а также для установления бацилловыделения у больных, принимавших непродолжительное время противотуберкулезные препараты. Особую ценность представляет биологическая проба при исследовании материалов от больных, страдающих урогенитальным туберкулезом. При отсутствии вивария и при необходимости дифференциации культур их пересылают в НИИ туберкулеза.
Целесообразно проводить одновременно заражение морских свинок и посев. Сочетание обоих методов дает больше возможностей обнаружить микобактерии в патологическом материале.
Обработка материала для заражения морских свинок. Для заражения морских свинок используют различный материал: мокроту, мочу, промывные воды бронхов, желудка, экссудаты, отделяемое ран, операционный материал и пр. Исследуемый материал обрабатывают 3-4% серной кислотой так же, как для посева. После обработки кислотой его дважды отмывают стерильным физиологическим раствором, чтобы не осталось кислоты, так как при попадании кислоты морской свинке под кожу может возникнуть язва. К полученному осадку добавляют 1 мл стерильного физиологического раствора и вводят морской свинке под кожу правой паховой области.
Если имеется возможность, то лучше заражать двух свинок. При этом одну морскую свинку забивают через 1,5, другую - через 3 месяца. За свинками проводят систематическое наблюдение, проверяя появление местного инфильтрата, его изъязвление, состояние регионарных лимфатических узлов и т.п. Степень микроскопических изменений может быть различной. Она зависит от количества и остаточной вирулентности микобактерий туберкулеза в патологическом материале.
Через 1,5-3 месяца проверяют чувствительность к туберкулину, вводя внутрикожно в предварительно выщипанную или обритую среднюю часть брюшка 0,1 мл туберкулина (100 ТЕ РРД-L). Реакцию учитывают через 24 и 48 часов. Положительной считается реакция в виде инфильтрата более 5 мм. Он наблюдается у свинок, инфицированных микобактериями туберкулеза. При наличии в патологическом материале достаточного количества вирулентных микобактерий уже через 2 недели на месте заражения может появиться инфильтрат или язвочка. Через месяц увеличиваются регионарные лимфатические узлы.
При забое морских свинок через 1,5 месяца отмечают инфильтрат, часто с распадом, в месте введения патологического материала, увеличение регионарных лимфатических узлов, единичные туберкулезные очажки в легких, в селезенке. При забое морских свинок через 3 месяца выявляется увеличение лимфатических узлов, как регионарных, так и отдаленных, поражение легких, печени и селезенки. Степень макроскопических изменений может быть различной. Она зависит от количества и вирулентности микобактерий туберкулеза, содержащихся в патологическом материале.
При заражении морских свинок в яичко вводят только 0,4 мл материала, обработанного указанным выше способом. Для заражения в яичко используют хорошо гомогенизированный материал: мочу, мокроту или промывные воды бронхов. При заражении двух морских свинок их также целесообразно забивать через 1,5 и через 3 месяца. По наличию специфических изменений (увеличение, уплотнение и наличие очагов в яичке и во внутренних органах) судят о наличии микобактерий в патологическом материале.
Иногда при обследовании олигобациллярных больных, при посевах мокроты или другого материала микобактерий не высеваются, а при заражении свинки могут определяться незначительные изменения в регионарном лимфатическом узле или в органах. В таких случаях следует сделать посев из органов морской свинки для получения культуры и ее дальнейшего изучения. Посев из органов свинки необходимо делать также во всех сомнительных случаях.
3. Дифференциация выделенных культур микобактерий
В современной бактериологии идентификация микобактерий представляет большие трудности. С одной стороны, в результате интенсивной и длительной химиотерапии туберкулеза изменилась морфология возбудителя туберкулеза. С другой стороны, участились случаи выделения из патологического материала атипичных (нетуберкулезных) микобактерий, являющихся самостоятельными видами. В практических лабораториях для отличия микобактерий туберкулеза от других кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять наиболее простые и доступные тесты, включающие бактериоскопические и биохимические исследования.
По последнему изданию определителя Берджи (1974), род микобактерий включает 30 видов, из которых большинство является сапрофитами и не патогенны для человека. Наряду с этим, ряд видов может вызывать поражение легких, лимфатических узлов и других органов (М. intracellulare, М. avium М. scrofulaceum, М. kansasii, М. fortuitum и др.). Наиболее патогенны для человека M. tuberculosis, М. bovis. Многие атипичные культуры по виду не отличаются от микобактерий туберкулеза. Для правильной оценки выделенных микобактерий - идентификации и определения их роли в заболевании человека необходимо провести дифференциацию выделенных культур с использованием специальных методик. Комплекс этих тестов - различный в зависимости от квалификации лабораторных работников, объема проводимых исследований и условий работы лаборатории.
3.1. Культуральный метод исследования
При культуральном методе исследования следует учитывать рост на яичных, агаровых и жидких питательных средах. Учитывается также скорость роста, температурный оптимум роста, морфология колоний, их цвет, морфология выросших микобактерий.
Микобактерии туберкулеза растут только на специальных яичных и полусинтетических жидких средах, содержащих набор солей и аминокислот, необходимых для жизнедеятельности микобактерий туберкулеза. Это отличает их от ряда других микобактерий, менее требовательных к питательным средам и растущих на простом мясо-пептонном агаре и агаре на переваре Хоттингера.
Микобактерии туберкулеза человеческого вида (М. tuberculosis) дают первичный рост при посеве патологического материала на 21-45-60 день. Пассажные культуры растут быстрее - на 10-14-21-й день. Рост на плотной яичной среде, содержащей глицерин, обычно пышный - эйгонический; культуры растут в виде шероховатых R-колоний, но могут быть гладкие, сливающиеся между собой (S-вариант), имеют кремовый оттенок. На жидкой питательной среде микобактерии туберкулеза человеческого вида образуют морщинистую грубую пленку, а иногда даже придонный крошковатый рост. Температурный оптимум 37-38°С. При 22°С и 45°С не растут. Морфологически в мазке, окрашенном по Цилю-Нильсену, выросшие на яичных средах микобактерии туберкулеза человеческого вида представляются в виде полиморфных тонких спирто- и кислотоустойчивых палочек, часто изогнутых, лежащих под углом друг к другу и образующих скопления. Патогенны для человека, обезьян, морских свинок, белых мышей.
Микобактерии бычьего вида (М. bovis), в отличие от микобактерий человеческого вида, хуже растут на яичных средах. Концентрация глицерина в среде более чем 0,75% влияет отрицательно на скорость размножения микобактерий бычьего вида. Они дают рост первичных культур на 30-45-60-й день в виде мелких гладких, влажных колоний (дисгонический рост). При пассажах рост наблюдается на 14-21-й день. Колонии не имеют пигмента, они - белого или сероватого цвета. На жидкой среде образуют более тонкую пленку, чем М. tuberculosis. Температурный оптимум, как и для микобактерий человеческого вида 37-38°С. При комнатной температуре (22°С) не растут. Бактериоскопически отличить их от микобактерий человеческого вида не представляется возможным. Патогенны для человека, рогатого скота, лабораторных животных.
Микобактерии птичьего вида (М. avium) в первичных культурах отличаются от микобактерий человеческого и бычьего вида морфологией колоний. Из патологического материала вырастают колонии или в виде приподнимающихся над поверхностью среды "лепешечек", или в виде "бубликов". Рост появляется к концу 1-го месяца, иногда позднее; при пересевах - к 7-10-му дню. В субкультурах растут гладким, влажным налетом. В жидкой среде дают помутнение. Культуры лучше растут при 43-45°С. Пассированные культуры могут давать также хороший рост и при 37°С, а иногда - при 22°С. Чаще всего колонии - кремоватого цвета, но возможно и более интенсивное окрашивание их в желтый цвет.
Микроскопически М. avium в мазках из культур представляют тонкие кислотоупорные палочки, более длинные и полиморфные они в мазках-отпечатках из органов зараженных кур, мышей или кроликов. Патогенны для человека, птиц свиней, кроликов, белых мышей. Встречаются в окружающей нас природе в водоемах.
Атипичные (нетуберкулезные) микобактерии. При выделении из патологического материала больных атипичных микобактерий важно установить значение их в патологии. Особого внимания заслуживают случае повторного выделения из патологического материала атипичных культур при отсутствии в исследуемом материале микобактерий туберкулеза. Атипичные культуры отличаются от микобактерий туберкулеза по ряду признаков в зависимости от их таксономической принадлежности. Для систематизации атипичных микобактерий пользуются группировкой Раньона, основанной, главным об разом, на двух признаках - скорости роста и пигментообразовании. По этой группировке все атипичные микобактерии разделены на 4 группы. Первые 3 группы медленнорастущие, 4-я группа - быстрорастущие. Наиболее патогенны для человека микобактерии I и III групп.
I группа - фотохромогенные микобактерии. Вырастают в темноте (в термостате) в течение 3-6 недель беспигментными, но после освещения дневным или электрическим светом приобретают пигмент желтого или желто-оранжевого цвета. К ним относятся: M. kansasii, M. simiae, M. balnei. Наибольшее значение в легочной патологии имеют M. kansasii.
M. kansasii (M. luciflavum) выделены и описаны Булер и Поллак в 1953 г. как возбудитель заболеваний людей. На яичной среде растут в виде шероховатых или гладких колоний, температурный оптимум 37°С. Морфологически - бактерии умеренной длины. Описаны 2 варианта M. kansasii: оранжевый (auranticum) и белый (album). Отличаются они только по способности образовывать пигмент, который зависит от наличия бета-каротиноидов. Остальные свойства указанных вариантов - одинаковы.
При введении морским свинкам вызывают инфильтраты и уплотнения регионарных лимфоузлов. Встречаются в водоемах. Природный источник не установлен.
II группа - скотохромогенные микобактерии. Образуют желто-оранжевый пигмент при росте в темноте, растут медленно 30-60 дней. К ним относятся M. aquae (M. gordonae), M. scrofulaceum.
M. scrofulaceum выделены Приссик, Массон (1958) из гноя лимфатического узла ребенка с лимфаденитом. На яичной среде растут в виде оранжевого цвета гладких или шероховатых колоний. Морфологически - короткие или длинные палочки. Растут при 25-37°С. Вызывают у детей поражения лимфоузлов и легких.
M. aquae (M. gordonae, Тар water scotochromogen - скотохромогены водопроводной воды). Выделены и описаны Бойялил с сотр. (1962). На яичной среде растут в виде оранжевых колоний при 25-37°С. Морфологически - палочка умеренной длины. Обнаружены в водоемах. Для лабораторных животных не патогенны.
III группа - нефотохромогенные микобактерии, не образующие пигмента или имеющие бледно-желтую окраску, которая не усиливается под воздействием света. Растут в течение 2-3-х или 5-6-ти недель. К ним относятся M. avium, M. xenopi, (M. terrae, M. gastri, M. intracellulare (M. battey, M. brunense). Последние описаны Куттино, Мак Кабе, Раньон (1965). M. avium дают рост на среде Левенштейна-Иенсена в виде непигментированных колоний при 37°С и 45°С. Морфологически - средней длины палочки. Патогенны для человека и для ряда лабораторных животных, а также для домашних животных (например, свиней). Встречаются в воде, в почве.
M. xenopi (M. littorale). Описаны Швабахер (1959). Выделены от жабы. Молодые культуры растут в виде непигментированных колоний; позднее появляется пигмент желтого цвета. Морфологически - длинные нитевидные палочки. Растут при 40-45°С, патогенны для человека.
M. terrae (Radish bacillus) бациллы редьки. Описаны Вайном (1966). Растут на среде Левенштейна-Иенсена в виде беспигментных колоний. Оптимум роста 37°С. Морфологически - палочка умеренной длины. Чаще всего для человека не патогенна. Встречается в окружающей нас природе.
IV группа - быстрорастущие. Растут в виде пигментных или беспигментных колоний, чаще в R-форме. Хороший рост дают в течение 2-5 дней при 25°С. К этой группе относятся потенциально патогенные микобактерии M. fortuitum и такие сапрофиты, как M. phlei, M. smegmatis и др.
M. fortuitum (M. minetti. M. giae) выделены и описаны Круз (1933), Пенсо (1952). Рост в субкультурах на яичной среде появляется на 2-4-й день в виде "розетки". Морфологически - короткие палочки. На среде Левенштейна-Иенсена могут поглощать краску и окрашиваться в зеленый цвет. Потенциально патогенны для человека. Широко распространены в природе.
Для правильного определения скорости роста необходимо работать со взвесью микобактерий густотой 2-3 мг/мл и засевать одну петлю диаметром 3 мм на пробирку со средой Левенштейна-Йенсена.
3.2. Дифференциация микобактерий
Культуральные тесты
Принцип. Для дифференцирования микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов от других микобактерий можно использовать способность атипичных микобактерий к росту на среде Левенштейна-Иенсена с 500-1000 мкг/мл салициловокислого натрия или паранитробензойной кислоты, добавленной к среде в той же концентрации, а также рост на среде с 1 мкг/мл тибона. Среды с этими препаратами ингибируют рост M. tuberculosis, M. bovis, в отличие от других микобактерий, которые растут хорошо. Контролем служит среда без препаратов.
3.2.1. Приготовление яичной среды с салициловокислым натрием
Ингредиенты:
1. Среда Левенштейна-Иенсена - 100 мл (до свертывания).
2. Натрий салициловокислый. К 99 мл среды Левенштейна-Иенсена (до свертывания) добавляют 1 мл раствора салициловокислого натрия, содержащего в 1 мл 50 000 или 100 000 мкг/мл препарата. Для получения такой концентрации препарата делают навеску 500 мг, добавляет 5 мл дистиллированной воды и получают разведение 100 000 мкг/мл. Для получения 50 000 мкг/мл берут 2 мл предыдущего раствора и добавляют 2 мл дистиллированной воды. 1 мл одного из полученных растворов добавляют в яичную массу, хорошо перемешивают, разливают по 5 мл в пробирки и свертывают как обычно (в аппарате для инактивации и свертывания сыворотки при 85°С в течение 45 минут).
3.2.2. Приготовление среды с паранитробензойной кислотой.
Ингредиенты
1. Паранитробензойная кислота.
2. Едкий натр (Iн NaOH),
3. Соляная кислота (Iн HCl).
4. Среда Левенштейна-Иенсена (до свертывания).
50 мг п-нитробензойной кислоты хорошо растирают в ступке пестиком, добавляют 5 мл дистиллированной воды и 20-24 капли 4% NaOH до pH - 8 (по бумажке). После этого добавляют 1-2 капли 10% HCl до pH - 7,0. Все это прибавляют к 95 мл яичной среды, предварительно профильтрованной. Получают концентрацию паранитробензойной кислоты 500 мкг/мл.
3.2.3. Приготовление яичной среды с тибоном
Принцип. Тибон (тиосемикарбазон пара-ацетаминобензальдегид) - противотуберкулезный препарат второго ряда. Туберкулезные микобактерии человеческого и бычьего видов чувствительны к этому препарату, тогда как другие нетуберкулезные микобактерии, за исключением M. kansasii, к этому препарату устойчивы.
Ингредиенты
1. Тибон.
2. Этиловый спирт.
3. Среда Левенштейна-Иенсена (до свертывания).
Готовят раствор тибона, содержащий 2 000 мкг/мл препарата. Для этого к 10 мг тибона добавляют 5 мл спирта. Из указанного разведения делают второе разведение - 1 000 мкг/мл (к 2 мл первого разведения добавляют 2 мл дистиллированной воды). 1 мл второго разведения добавляют к 99 мл яичной массы - получают концентрацию тибона 10 мкг/мл и разливают в пробирки по 5 мл. Среду в пробирках свертывают в аппарате для инактивации сыворотки.
Все три описанные теста (способность роста на средах с салициловой, паранитробензойной кислотами и тибоном) служат для отличия микобактерий туберкулеза от атипичных микобактерий. Следует упомянуть еще об одном простом тесте, который в комплексе с указанными выше позволяет дифференцировать микобактерии туберкулеза от атипичных быстрорастущих - это толерантность некоторых видов микобактерий к NaCl.
3.2.4. Рост на среде с 5% NaCl
Принцип. Метод основан на способности атипичных микобактерий IV группы (быстрорастущих) расти на среде с 5% NaCl. Помимо этой группы, на этой среде растут только M. triviale (III группа) и M. flavescens (II группа). Все остальные микобактерии, в том числе M. tuberculosis и M. bovis, на этих средах не растут.
Ингредиенты.
1. Натрий хлористый (хч).
2. Солевая основа среды Левенштейна-Иенсена.
3. Яичная смесь среды Левенштейна-Иенсена.
К солевой основе среды Левенштейна-Иенсена добавляют хлористый натрий из расчета 5 г на 100 мл солевой основы (5%). Полученный раствор стерилизуют при (120°С 20 минут), добавляют яичную массу. Далее приготовляют среду, как указано в рецепте приготовления среды Левенштейна-Иенсена.
На все указанные выше среды засевают по 0,2 мл исследуемой культуры, густотой 2-3 мг/мл. Помимо роста на этих средах, используют способность микобактерий по-разному расти на жидких питательных средах. Атипичные микобактерии, в отличие от истинных туберкулезных микобактерий, обладающих корд-фактором и растущих поэтому в виде "кос", "жгутов", "усов" - в тесном переплетении отдельных палочек друг с другом, растут более диффузно, в виде кучек. Это может служить дифференциальным признаком. Однако, устойчивые к препаратам группы ГИНК микобактерии туберкулеза полностью или частично утрачивают корд-фактор. Поэтому для дифференциации туберкулезных культур от атипичных определение корд-фактора должно использоваться в комплексе с другими тестами.
Для отличия микобактерий туберкулеза человеческого вида от других микобактерий (M.bovis, M. avium и атипичных микобактерий) используют различные биохимические методы исследования, которые в комплексе с биологическим методом позволяют идентифицировать культуры.
3.3. Биохимические методы исследования
Для отличия микобактерий туберкулеза от других микобактерий, а также для различия M. tuberculosis от M. bovis проводят следующие определения: 1) содержание ниацина, 2) никотинамидазной активности, 3) нитратредуктазной активности, 4) каталазной и пероксидазной активности.
3.3.1. Ниациновый тест
Является одним из основных. Он дает возможность отличить микобактерии человеческого вида от других микобактерий.
Принцип. Известно, что микобактерии туберкулеза человеческого вида синтезируют никотиновую кислоту (ниацин) в 10 раз больше, чем микобактерии бычьего, птичьего вида или атипичные. На этом основании были предложены химические методы определения никотиновой кислоты при помощи цианистых соединений, с которыми никотиновая кислота дает ярко-желтое окрашивание. Этот тест получил название ниацинового.
Сравнительное изучение различных методов определения ниацина показало, что наиболее результативным из них является модифицированный метод Бенике и Лисбоа, несколько модифицированный и описанный Э.И.Тюри и M.Э.Тюри (Лабораторное дело, 1964, 7).
Указанный метод определения ниацина требует для работы применения цианистого калия, работа с которым должна проводиться под вытяжным шкафом и требует определенных условий, что ограничивает широкое применение этого теста. В связи с этим, особого внимания заслуживает метод определения ниацина бумажными полосками, предложенный Кубика и Кильбурн, в модификации Бараускене.
Определение ниацина бумажными полосками
Преимущество этого метода в использовании вместо цианистого калия роданистого калия - вещества нелетучего и более доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа дать ответ о принадлежности выросшей на плотной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.
Принцип метода состоит в экстракции ниацина из микобактерий дистиллированной водой и определение его с помощью бумажных полосок, пропитанных реактивами.
Приготовление реактивов
1. Раствор ПАСК. В пробирку наливают 1,75 мл 95° спирта, 0,25 мл диметилсульфоксида и добавляют 400 мг ПАСК. Смесь подогревают на водяной бане при 56°С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.
2. Раствор роданистого калия. Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты (200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).
3. Раствор хлорамина "Б". 3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56-60°С при встряхивании. Горячий раствор капают на полоски.
4. Индикаторные полоски готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11. Один конец полоски, размером 60х8 мм, отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на бумагу наносят по одной капле свежеприготовленных реактивов в следующем порядке: 20% раствор ПАСК - на отмеченный карандашом конец, 60% раствор роданистого калия - посередине полоски и 50% раствор хлорамина "Б" - на другой конец. Между каплями должны оставаться сухие промежутки. Бумажки высушивают при комнатной температуре в темноте в течение 24 часов, после чего хранят их в холодильнике в пробирках, закрытых резиновыми пробками. Индикаторные полоски остаются активными в течение 3-х месяцев и более. Для получения более четкой реакции рекомендуется нанести повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю.
Ход исследования. Водный экстракт микобактерий получают путем добавления в пробирку с культурой 1-1,5 мл дистиллированной воды и выдерживания пробирок в горизонтальном положении, чтобы все колонии хорошо отмылись водой в течение 2-3 часов в термостате. Затем 0,6 мл экстракта микобактерий отсасывают пипеткой в пробирку.
Индикаторную полоску помещают концом, помеченным карандашом, в пробирку с 0,6 мл исследуемого экстракта микобактерий. Пробирку закрывают резиновой пробкой и покачивают, пока вся полоска не пропитается экстрактом. При положительном ниациновом тесте через 15-30 минут жидкость окрашивается в ярко-желтый цвет. Дегазация пробирки после проведения реакции осуществляют путем добавления 10% раствора нашатырного спирта.
Использование бумажных полосок для определения ниацина дает возможность применять этот тест во всех практических лабораториях.
3.3.2. Определение амидазной активности
Принцип определения амидазной активности основан на дезаминировании амидов и выделении аммиака, который определяется специальными реактивами. Существует два метода определения амидазной активности - количественный биохимический, по Бенике, и качественный бактериологический, по Такэ.
Метод Бенике
Амидный ряд, по Бенике, включает 10 амидов, однако в лабораторной практике можно пользоваться тремя амидами: мочевина, никотинамид и пиразинамид. По Бенике, растворы амидов следует готовить, исходя из следующих количеств амида на 100 мл дистиллированной воды: мочевина - 9,8 мг, никотинамид - 20 мг, пиразинамид - 20 мг. Ход реакции определения амидазной активности биохимическим методом приведен на примере никотинамидазной активности.
Определение никотинамидазной активности
Принцип Никотинамидаза - это одна из ациламидаз. Она способствует переходу никотинамида в никотиновую кислоту - ниацин. При этом освобождается аммиак, который улавливается соответствующими реактивами. Наличие никотинамидазы, наряду с положительным ниациновым тестом, свидетельствует о принадлежности микобактерий к человеческому виду.
Реактивы
1. Феноловый раствор. Растворить 25 г кристаллического фенола в 10 мл воды, добавить при помешивании 54 мл 5 и раствора NaOH (20 г NaOH + 80 мл дистиллированной воды) и довести объем до 100 мл. Хранить на холоду в банках из темного стекла.
2. Раствор гипохлорита. Размолоть 25 г хлорной извести, просеять и растворить в 300 мл дистиллированной воды, добавить при перемешивании 135 мл водного раствора углекислого калия (20 г безводной соли К2CO3 в 100 мл дистиллированной воды, предварительно прокипяченной для удаления аммиака), тщательно размешать: быстро нагреть до 90°С, охладить и довести до 500 мл. Фильтруют небольшую часть смеси и испытывают на присутствие ионов кальция. Если проба положительная (раствор мутнеет), то добавляют еще углекислого калия до получения отрицательной пробы (раствор - прозрачный). Профильтровать смесь и хранить раствор в холодильнике, в небольших банках из темного стекла. Реактив может храниться в холодильнике 1-2 месяца.
3. Водный раствор никотинамида - 200 мкг/мл. Для этого 2 мг никотинамида растворяют в 10 мл дистиллированной воды.
4. 1/15М фосфатный буфер, pH - 7,2.
5. 0,07% MnSO4.
Ход исследования. К 0,5 мл густой бактериальной взвеси 20 мг/мл (4 полных платиновых лопатки культуры растирают в 1/15М фосфатном буфере, pH - 7,2), добавляют 0,5 мл раствора никотинамида. Смесь выдерживают в термостате 15-16 часов. Затем определяют аммиак по Расселу. Для этого к смеси добавляют 0,2 мл 0,07% MnSO4, 2 мл фенолового реактива в 1 мл гипохлорита. Пробирки помещают в водяную баню при 100°С на 15-20 минут. Появление сине-зеленого окрашивания свидетельствует о наличии в среде аммиака, а следовательно, о принадлежности культуры к человеческому виду. Контролем является пробирка с 0,5 мл никотинамида и 0,5 мл буфера, которую также помещают в термостат. В контрольной пробирке реакция на аммиак должна быть отрицательной. В случае появления бледно-голубого окрашивания оно учитывается при оценке результатов в опытной пробирке.
Ценность ниациновой пробы, а также реакции на никотинамидазу велика еще и потому, что на обе реакции не влияет развитие устойчивости к тубазиду у культур, выделенных от больных.
Метод Такэ
Другим способом определения амидазной активности является бактериологический качественный тест Такэ.
Принцип метода состоит в выращивании микобактерий на агаровой среде, содержащей амиды (мочевину, никотинамид, пиразинамид), и появление специфического ржавого окрашивания при добавлении реактива Несслера к выросшим культурам в случае, если ацетиламидаза вырабатывается в процессе роста микобактерий в достаточном количестве.
Реактивы.
1. Никотинамид.
2. Пиразинамид.
3. Мочевина.
4. Реактив Несслера.
5. Агаровая среда:
пептон,
натрий хлористый,
глюкоза,
калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РO4)
глицерин.
Ход исследования. Приготовление агаровой среды. 1 г пептона, 20 г агар-агара или агара Дифко, 5 г NaCl, 1 г глюкозы, 2 г KH2PO4, 10 мл глицерина растворяют в дистиллированной воде при нагревании, доводя конечный объем до 1 литра, pH - 6,9. Горячую среду разливают по пробиркам и автоклавируют при 120°С 30 минут. После стерилизации агар в пробирках скашивают. Приготовляют растворы амидов в дистиллированной воде:
мочевина - 40 мг/мл,
никотинамид - 30 мг/мл,
пиразинамид - 20 мг/мл.
Растворы никотинамида и пиразинамида стерилизуют в водяной бане при 100°С в течение 30 минут. Раствор мочевины фильтруют через бактериальный фильтр (Зейца). Стерильный раствор амидов вносят по 0,25 мл в пробирки с питательной средой и оставляют последние в горизонтальном положении 2-3 дня, так, чтобы раствор впитался в поверхность питательной среды. (По подсчетам, количество мочевины, никотинамида и пиразинамида на 1 см2 поверхности среды составит соответственно - 1.000, 750 и 500 мкг/см2).
В пробирки с амидами засевают 0,2 мл густой взвеси культуры испытуемых микобактерий (1 мг/мл). Посевы инкубируют при 37°С. При появлении роста (через 2-3 недели) добавляют 0,5 мл реактива Несслера. Появление ржавого окрашивания свидетельствует о положительной реакции (о наличии у бактерий соответствующей амидазы). Контролем являются посевы в пробирках без амидов.
Различные виды микобактерий отличаются по ферментативной активности по отношению к различным амидам. Различия эти представлены в таблице 1.
Таблица 1
Амидазная активность отдельных видов микобактерий
-----------------------T---------------------------------T---------------
Виды микобактерий ¦ Амиды ¦ Амидазный код
+---------T-----------T-----------+
¦ мочевина¦никотинамид¦пиразинамид¦
¦ (3) ¦ (5) ¦ (6) ¦
-----------------------+---------+-----------+-----------+---------------
M.tuberculosis + + + 3, 5, 6
M.bovis + - - 3
I M.kansasii + + - 3, 5
II M.gordonae
(M.aquae) -/+ - - 0, 3
II M.scrofulaceum + + + 3, 5, 6
III M.avium - + + 5, 6
III M.xenopi - + + 5, 6
III M.intracellulare - + + 5, 6
III M.terrae - + + 5,6; 0*
IV M.fortuitum + +/- +/- 3
IV M.smegmatis + + + 3, 5, 6
IV M.phlei + + + 3, 5, 6
Обозначения: + реакция положительная
- реакция отрицательная
+/- реакция может быть положительной или отрицательной
------------------------------
* M.terrae, описанные Тсукамурой - 5,6
M.terrae, описанные Вайном - 0
3.3.3. Определение формамидазной активности
Для штаммов кислотоустойчивых быстрорастущих сапрофитов характерно наличие формамидазной активности. Этот фермент отсутствует у микобактерий туберкулеза и у большинства атипичных микобактерий, классифицируемых по Раньону.
Принцип реакции состоит в способности формамидазы расщеплять формамид с образованием аммиака, выделение которого улавливается в реакции с фенолом и гипохлоритом.
Техника реакции (модифицированная методика Дыхно) аналогична реакции на никотинамидазу. Формамид используется в концентрации 0,2 мл на 250 мл дистиллированной воды. Для проведения реакции необходимо иметь ингредиенты высокого качества.
3.3.4. Определение нитратредуктазы
При дифференцировании микобактерий туберкулеза пользуются также реакцией восстановления нитратов в нитриты. Реакция восстановления нитратов дает возможность дифференцировать микобактерии человеческого вида, обладающие нитратредуктазой, от микобактерий бычьего и птичьего видов и от некоторых атипичных, у которых этот фермент отсутствует. Исключение составляют фотохромогенные микобактерии (M. kansasii) и некоторые из III и IV групп.
Принцип. Активность нитратредуктазы определяется по количеству восстановленного из нитрата нитрита, который дает цветную реакцию с пара-диметиламинобензальдегидом.
Реактивы.
1. 0,067М фосфатный буфер, pH - 7,1, содержащий 0,1% нитрата натрия.
2. 2% раствор (вес/объем) пара-диметиламинобензальдегида в 10% HCl.
3. 10%, раствор соляной кислоты.
Для реакции используют 3-4-недельные культуры, выращенные на яичной среде.
Ход исследования. 50 мг влажного веса 3-4-недельной культуры суспендируют в 5 мл (можно суспендировать 10 мг культуры - 1 полная платиновая лопатка - в 1 мл) 0,067М фосфатного буфера, pH - 7,1, содержащего 0,1% нитрата натрия, и инкубируют при 37°С 15-16 часов. Образование нитрита проверяется добавлением 2 капель 2% раствора пара-диметиламинобензальдегида в 10% HCl + 1 мл 10% HCl. Появление желтой окраски свидетельствует о принадлежности культуры к микобактериям человеческого вида (метод Тсукамура).
Помимо активности указанных ферментов для отличия микобактерий туберкулеза от других кислотоустойчивых микобактерий можно использовать различную активность окислительно-восстановительных ферментов.
Дифференциация микобактерий по окислительно-восстановительным
ферментам
В окислительно-восстановительных процессах микробной клетки активное участие принимают такие ферменты, как каталаза и пероксидаза. У микобактерий туберкулеза (человеческого и бычьего видов), чувствительных к препаратам группы ГИНК, выявляется активность обоих ферментов параллельно. При этом у чувствительных культур наблюдается быстрое обильное выделение пузырьков кислорода, обусловленное деятельностью каталазы, и окрашивание колоний в темно-коричневый цвет. Появление коричневого пигмента объясняется переходом пирогаллола в пурпурогаллин в присутствии перекиси водорода под влиянием пероксидазы. У культур, устойчивых к препаратам группы изоникотиновой кислоты, активность этих ферментов резко понижена, и колонии или едва окрашиваются, или - при высокой степени устойчивости к тубазиду - остаются бесцветными.
В отличие от микобактерий туберкулеза, у атипичных микобактерий, независимо от устойчивости к тубазиду, каталазная активность всегда выражена резко, тероксидазная же, как правило, не выявляется.
3.3.5. Определение каталазной и пероксидазной активности
Принцип реакции состоит в расщеплении перекиси водорода ферментом каталазой на воду и атомарный кислород, что сопровождается выделением пузырьков и переходом пирогаллола в пурпурогаллин в присутствии перекиси водорода под влиянием пераксидазы.
Реактивы.
1. 0,5% пирогаллол. 50 мг чистого пирогаллола растворить в 10 мл дистиллированной воды.
2. 2% пергидроль. 0,2 мл пергидроля развести в 10 мл дистиллированной воды.
Оба раствора готовят непосредственно перед употреблением, смешивают и наливают в пробирку так, чтобы покрыть культуру (модифицированная методика Богена).
Ход исследования. Оба раствора сливают в колбу в равном количестве и наливают по 6-8 мл в пробирку с культурой. В зависимости от количества проверяемых культур объем приготовляемых растворов соответственно увеличивают.
Учет реакции активности каталазы проводят через 5 минут по активному выделению пузырьков кислорода. Реакцию на пероксидазу учитывают спустя 1,5-2 часа по окрашиванию колоний в темно-коричневый цвет.
Степень активности каталазы обозначают по 3-бальной системе:
+++ обильное выделение пузырьков кислорода в 1-ю минуту,
++ умеренное выделение пузырьков кислорода,
+ единичные пузырьки.
При отсутствии пузырьков реакция считается отрицательной.
Активность пероксидазы оценивается также по 3-бальной системе:
+++ темно-коричневая окраска колоний,
++ коричневая окраска колоний,
+ бледно-коричневая окраска колоний.
При отрицательной реакции цвет колоний не меняется.
Ценной реакцией для отличия микобактерий туберкулеза от атипичных микобактерий является проба на термостабильность каталазы.
Термостабильность каталазы
Каталаза у кислотоустойчивых микобактерий разная. У вирулентных микобактерий она быстро и легко разрушается при нагревании до 65-68°С. У атипичных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов она термостабильна.
3.3.6. Определение активности термостабильной каталазы
Приготавливают 3 мл густой взвеси микобактерий (3 платиновых лопатки культуры растирают, добавляя постепенно 3 мл дистиллированной воды). 1,5 мл взвеси переносят в центрифужную пробирку, которую нагревают в водяной бане при 68°С в течение 10 минут. Затем пробирку охлаждают и на предметное стекло наносят по 1 капле взвеси: на один конец - непрогретую (служит контролем), на другую - взвесь после нагревания. К той и другой взвеси добавляют по 1 капле пергидроля. Образование пузырьков свидетельствует об активности фермента, отсутствие - о его угнетении. На основании этой реакции легко отличить микобактерии туберкулеза, у которых каталаза всегда термолабильна, от большинства атипичных и кислотоустойчивых сапрофитов с резко термостабильной каталазой.
Термостабильность каталазы, так же как и ее активность, учитывается по 3-балльной системе:
+++ обильное выделение пузырьков кислорода,
++ умеренное выделение пузырьков кислорода,
+ единичные пузырьки кислорода.
Соотношение окислительно-восстановительных ферментов у разных видов микобактерий показано в табл. 2.
Таблица 2
Идентификация микобактерий по окислительно-восстановительным
ферментам и ниациновой пробе
----------------------------T--------T-----------T----------T------------
Микобактерии ¦Каталаза¦Пероксидаза¦Термоста- ¦Ниациновая
¦ ¦ ¦бильность ¦ проба
¦ ¦ ¦каталазы ¦
¦ ¦ ¦ ¦
----------------------------+--------+-----------+----------+-----------
Атипичные + - + -
M.tuberculosis, чувстви-
тельные к тубазиду + + - +
M.tuberculosis, устойчивые
к тубазиду - - - +
M.bovis + + - -
3.3.7. Реакция гидролиза твина 80
Важной реакцией для идентификации микобактерий внутри II и III групп, по Раньону, является реакция гидролиза твина 80. Штаммы скотохромогенные, которые в течение нескольких часов разрушают твин 80, как правило, не имеют клинического значения. Твин-80 связывает нейтральный красный, и смесь до реакции имеет соломенно-желтый цвет. Принцип реакции - в энзимном гидролизе твина-80. При этом происходит освобождение нейтрального красного и окраска восстанавливается от розовой до красной. Положительная реакция отмечается у M. aquae (в отличие от M. scrofulaceum, у которых реакция отрицательная), а из III-й группы она положительна только у M.terrae.
Реактивы.
1. 1/15М фосфатный буфер, pH - 7-100 мл.
2. Твин-80 - 0,5 мл.
3. Основной нейтральный красный, 0,1% - 2 мл. Лучше растворить 0,1 г нейтраль-рот не в 100, а в 85 мл дистиллированной воды. Смешать все три реагента. Разлить по 4 мл в пробирки и автоклавировать при 120°С 15 минут. Сутки проверяют на стерильность в термостате и хранят в холодильнике, в темноте. Стабильность раствора - не более 2-х недель.
Ход исследования. Эмульгируют 3 платиновые лопатки культуры в пробирках с приготовленным субстратом (твин-80 с нейтральным красным). Пробирки помещают в термостат. Реакцию проверяют через 4 часа, на 5-й и 10-й день. Тест считается положительным, если розовато-красная окраска появилась до 10-го дня, отрицательной, если окраска не появилась (модифицированная методика Вайна). Контролем является пробирка с чистой средой.
При описании биохимических тестов мы остановились на наиболее простых пробах, которые дают возможность отличить микобактерии туберкулеза от атипичных и различать некоторые виды атипичных микобактерий внутри группы Раньона. При дифференциации микобактерий следует помнить, что, помимо использования комплекса тестов, применяемых при изучении атипичных культур, необходимо пользоваться обязательными для каждого вида тестами (так называемые ключевые тесты), проведение которых облегчает идентификацию культур. Приводим ключевые тесты для отдельных видов микобактерий:
-------------------------T-----------------------T-----------------------
Виды микобактерий ¦ Тесты ¦Результаты теста, свой-
¦ ¦ственные для данного
¦ ¦вида микобактерий
-------------------------+-----------------------+-----------------------
Скорость роста Медленный
Ниацин +
Восстановление нитратов +
M.tuberculosis Каталаза 68°С -
Образование пигмента
в темноте -
Рост на среде с
500 мкг/мл ПНБ -
-------------------------------------------------------------------------
M.bovis Скорость роста Медленный
Ниацин -
Восстановление нитратов -
Каталаза 68°С -
Образование пигмента
в темноте -
Рост на среде с
500 мкг/мл ПНБ -
-------------------------------------------------------------------------
M.kansasii Скорость роста Медленный
Восстановление нитратов +
Каталаза 68°С +
Образование пигмента
после освещения +
Гидролиз твина-80 +
-------------------------------------------------------------------------
M.scrofulaceum Скорость роста Медленный
Каталаза 68°С +
Образование пигмента
в темноте +
Гидролиз твина-80 -
-------------------------------------------------------------------------
M.gordonae Скорость роста Медленный
(M. aquae) Восстановление нитратов -
Образование пигмента
в темноте +
Гидролиз твина-80 +
-------------------------------------------------------------------------
M.xenopi Скорость роста Медленный
Восстановление нитратов -
Образование пигмента
в темноте +
Гидролиз твина-80 -
-------------------------------------------------------------------------
M.avium Скорость роста Медленный
Ниацин -
Восстановление нитратов -
Гидролиз твина-80 -
-------------------------------------------------------------------------
M.intracellulare Скорость роста Медленный
Ниацин -
Восстановление нитратов -
Гидролиз твина-80 -
-------------------------------------------------------------------------
M.gastri Скорость роста Медленный
Ниацин -
Восстановление нитратов -
Каталаза 68°С -
Образование пигмента
на свету -
Гидролиз твина-80 +
-------------------------------------------------------------------------
M.terrae Скорость роста Медленный
Ниацин -
Восстановление нитратов +
Образование пигмента
на свету -
Гидролиз твина-80 +
-------------------------------------------------------------------------
M.fortuitum Скорость роста Быстрый
Восстановление нитратов +
Образование пигмента
в темноте -
Толерантность к 5%
NaCl +
-------------------------------------------------------------------------
M.smegmatis Скорость роста Быстрый
Образование пигмента
в темноте -
Толерантность к 5%
NaCl +
-------------------------------------------------------------------------
M.phlei Скорость роста Быстрый
Образование пигмента
в темноте +
Толерантность к 5%
NaCl +
-------------------------------------------------------------------------
Помимо перечисленных тестов, для всех беспигментных культур необходимо определять ниациновую пробу, и если она - отрицательна, проверять амидазную активность. Использование описанных тестов дает возможность разделить атипичные культуры на патогенные для человека и случайно сопутствующие сапрофиты, не оказывающие влияния на заболевание.
Для клиники особое значение имеют следующие виды атипичных микобактерий:
1. M. kansasii
2. M. scrofulaceum
3. M. xenopi
4. M. avium
5. M. intracellulare
6. M. fortuitum
Для атипичных микобактерий, помимо указанных нами особенностей - скорости роста, пигментообразования, морфологии колоний и палочек - характерны: отрицательная ниациновая проба, отсутствие пероксидазной активности при сохранении активности каталазы, выраженная термостабильность каталазы у большинства микобактерий, рост на питательных средах с пара-нитробензойной кислотой и салициловокислым натрием, потеря в большинстве случаев способности образования корд-фактора. Характерным также для атипичных микобактерий является первичная устойчивость к большинству противотуберкулезных препаратов 1 ряда (главным образом, ПАСК, ГИНК), а из препаратов II ряда - к тибону.
Для отличия M.tubersulosis и M.bovis от нетуберкулезных микобактерий, различия их друг от друга, а также для различия атипичных микобактерий внутри групп удобно пользоваться помещенными ниже схемами.
Основные тесты для отличия M.tuberculosis, M.bovis от других
микобактерий
1. Ниациновый тест
+ -
M.tuberculosis M.bovis
2. Отсутствие роста на среде Л.-И. с 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты или салициловокислого натрия.
3. Отрицательная реакция на термостабильность каталазы.
Основные тесты, отличающие M.tuberculosis от M.bovis
Ниациновый тест Никотинамидаза Восстановление
нитратов
M.tuberculosis+ M.tuberculosis+ M.tuberculosis+
M.bovis- M.bovis- M.bovis-
I группа. Фотохромогенные микобактерии
25°С +
37°С + (-)
45°С -
NO3 ___________________ NO2 + __________________ NO3 ______________ NO2 -
_______________________
твин+ твин+ твин-
M.kansasii M.simiae M.marinum
Для различия внутри группы необходимы следующие тесты:
1. Образование пигмента
2. Гидролиз твина-80
3. Ниациновый тест (M.simiae+-)
4. Восстановление нитратов
5. Рост при 25 и З7°С
II группа. Скотохромогенные микобактерии
25°С +
37°С +
45°С -
NО3 _________ NO2 -
___________________________________
твин+ твин+ твин-
уреаза+ уреаза- уреаза+
M.aquae M.aquae M.scrofulaceum
(var ureolyticum)
M.gordonae
III группа. Нефотохромогенные микобактерии
Основные тесты
25°С +- 45°С +- Восст. Гидролиз
нитратов твина-80
M.avium +- M.avium +- M.terrae + M.avium -
M.intracel +- M.intracel +- M.avium - M.intracel -
M.terrae + M.xenopi + M.intracel - M.xenopi -
M.gastri + M.gastri - M.gastri - M.gastri +
M.triviale + M.triviale - M.xenopi - M.terrae +
M.xenopi - M.terrae - M.triviale + M.triviale +
Каталаза 68°С Амидазная активность
M.avium + 5,6
M.intracel + 5,6
M.xenopi + 5,6
M.triviale + 5,6; 0*
M.terrae + 0.
* M.terrae Вайна - 0
M.terrae Теукамура - 5,6
IV группа. Быстрорастущие микобактерии
Основные тесты
25°С + M.smegmatis, M.phlei, M.fortuitum
37°С + " " "
45°С +- M.smegmatis + M.phlei + M.fortuitum - 52°С + M.phlei
Гидролиз твина-80
M.phlei + M.smegmatis + M.fortuitum +-
3.4. Биологический метод идентификации кислотоустойчивых
микобактерий
Помимо широкого использования для дифференциации культур биохимических тестов, при установлении видовой принадлежности культур пользуются биологическим методом.
Известно, что восприимчивость экспериментальных животных к микобактериям человеческого, бычьего и птичьего видов - различная. Поэтому в лабораторной практике экспериментальные исследования проводят на морских свинках, кроликах, белых мышах и курах.
Для заражения морских свинок под кожу пользуются двумя дозами: 0,1 мг и 0,001 мг; кроликов - внутривенно 0,1 мг и 0,001 мг и белых мышей - внутривенно дозой 0,1 мг. Кур заражают в вену крыла 0,1 мг и 1 мг.
Культуры человеческого вида (Mycobacterium tuberculosis), чувствительные к препаратам ГИНК, приводят к гибели морских свинок (к 2-3-м месяцам) и белых мышей (к 20-30-му дню). На секции у свинок - картина тяжелого туберкулеза с поражением внутренних органов и лимфатических узлов, у белых мышей - поражение легких.
Микобактерии бычьего вида (Mycobacterium bovis) вызывают гибель кроликов (к 1,5-2-м месяцам) с поражением почек, легких, а также морских свинок (примерно через 2 месяца) и белых мышей (на 20-30-й день).
Микобактерии птичьего вида (Mycobacterium avium) приводят к гибели кур (на 30-50-й день), кроликов (на 20-40-й день), а у белых мышей вызывают поражение легких, печени и увеличение селезенки. У свинок отмечается лишь инфильтрат под кожей на месте введения культуры, а иногда - небольшое увеличение регионарных лимфатических узлов. Следует помнить, что у кур и кроликов туберкулезные бугорки на органах чаще всего отсутствуют. На секции у кур видна резко увеличенная печень, а у кроликов - также и селезенка.
Подтверждением того, что причиной гибели животных были M.avium, являются мазки-отпечатки из печени, селезенки и костного мозга. В препаратах обнаруживается значительное количество полиморфных кислотоустойчивых микобактерий.
Идентификация микобактерий туберкулеза по культуральным, биохимическим и биологическим методам представлена в табл.3.
Таким образом, для отличия микобактерий туберкулеза от других кислотоустойчивых микобактерий используют комплекс признаков: культуральные свойства, отсутствие способности к росту на яичной среде с пара-нитробензойной кислотой или салициловокислым натрием, способность к образованию корд-фактора, термостабильность каталазы и др.
Перечисленные признаки отличают микобактерии туберкулеза от атипичных микобактерий.
Таблица 3
Идентификация микобактерий туберкулеза культуральным, биохимическим,
биологическим методами
--------------T---------------------------------T----------T------------T
Виды микобак- ¦Рост пассажных культур на разных¦Морфология¦Цвет колоний¦
терий ¦ средах при разных температурах ¦ колоний ¦ ¦
¦ ¦ ¦ +
+------------T------------T-------+ ¦ ¦
¦Яичная среда¦Среда Школь-¦Агар- ¦ ¦ ¦
¦ ¦ никовой ¦глиц. ¦ ¦ ¦
+---T---T----+------------+---T---+ ¦ ¦
¦25°¦37°¦45° ¦ 37° ¦25°¦37°¦ ¦ ¦
--------------+---+---+----+------------+---+---+----------+------------+
+
Человеческий - + - грубая - - R Кремовый
пленка
+
Бычий - + - тонкая - - RS Белый
пленка (серый)
+
Птичий -/+ + + придонный - - S Кремовый
рост
+ растут, - не растут + реакция положительная
-/+ некоторые культуры растут - реакция отрицательная
--------------T-------------------------------T-------------------------¬
Виды микобак- ¦ Биохимические тесты ¦ Вирулентность для ¦
терий ¦ ¦ животных ¦
+-------T-------T-------T-------+------T------T-----T-----+
¦Ниаци- ¦Никоти-¦Восста-¦Корд- ¦Морс- ¦Кроли-¦Мыши ¦Куры ¦
¦новый ¦нами- ¦новле- ¦фактор ¦кие ¦ки ¦ ¦ ¦
¦тест ¦дазная ¦ние ¦ ¦свинки¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦актив- ¦нитра- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ность ¦тов ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
--------------+-------+-------+-------+-------+------+------+-----+------
Человеческий + + + + + - + -
Бычий - - - + + + + -
Птичий - - - - +- + + +
+ вирулентные
+- слабо вирулентные
- невирулентные
Обозначения:
(в числителе - большинство штаммов, в знаменателе - меньшинство)
Атипичные микобактерии в большинстве случаев не патогенны для лабораторных животных. Патологические изменения в органах могут быть получены в большинстве случаев при внутривенном или внутрибрюшинном заражении морских свинок, кроликов и мышей большими дозами бактерий (1 мг или более). В практике для отличия непатогенных микобактерий от туберкулезных можно пользоваться внутрикожным заражением морских свинок введением взвеси 0,1 мг микобактерий в 0,2 мл физиологического раствора.
На введение M.kansasii, M.scrofulaceum, M.intracellulare, M.avium и некоторых других развивается самозаживающая язва, в отличие от генерализованного процесса, возникающего при внутрикожном введении микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего вида.
При изучении выделенных штаммов встречаются определенные трудности. Может иметь место одновременное выделение типичных и атипичных микобактерий. В таком случае значение имеет кратность выделения атипичных микобактерий, обилие роста. Особого внимания заслуживают случаи повторного выделения только атипичных микобактерий. Вопрос о значении их в этиологии заболевания решается на основании клинико-рентгено-бактериологических исследований.
Из всех приведенных методов исследования ни один, сам по себе, не может ответить на вопрос о принадлежности штамма к одному из видов. Только комплексное применение ряда бактериологических, биохимических, биологических методов исследования дает возможность правильно идентифицировать выделенные культуры. При идентификации микобактерий перед микробиологами встают следующие вопросы: являются ли выделенные микобактерии туберкулезными, и к какому виду они принадлежат.
Если выделяются культуры, отличные от туберкулезных, то необходимо уточнить, относятся ли они к атипичным, и к какой группе по Раньону. В зависимости от лаборатории, обслуживающей туберкулезные учреждения, объем тестов, используемых при идентификации микобактерий, подразделяется на более простые и доступные для каждого практического учреждения и более детальные, включающие ряд биохимических и биологических исследований. Последние проводятся в лаборатории института или в лаборатории при областном туберкулезном диспансере. 1-й комплекс исследований включает следующие наиболее простые тесты на основании которых решается вопрос о принадлежности штамма к туберкулезным или атипичным микобактериям:
1. Скорость роста.
2. Образование пигмента.
3. Рост на среде с пара-нитробензойной кислотой.
4. Каталазо-пероксидазная активность.
5. Термостабильность каталазы.
II комплекс исследований включает дополнительные бактериологические и биохимические тесты: первичная лекарственная устойчивость к препаратам 1-го ряда, рост на яичной среде с препаратами, ингибирующими рост микобактерий туберкулеза, рост в микрокультурах, образование виацина, ациламидазная активность, гидролиз твина-80 и подробное изучение культуральных и биологических свойств.
Биохимический метод идентификации микобактерий в сочетании с культуральным является быстрым, доступным и надежным. Он должен широко применяться в бактериологических лабораториях.
В таблице 4 представлена идентификация ряда видов микобактерий по комплексу бактериологических и биохимических тестов.
4. Определение чувствительности микобактерий туберкулеза
к противотуберкулезным препаратам
4.1. Критерии чувствительности микобактерий туберкулеза
к противотуберкулезным препаратам
Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам имеет существенное значение для тактики химиотерапии больных, для контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания. Изменение чувствительности микобактерий отмечается ко всем противотуберкулезным препаратам, однако отличается по степени, частоте и скорости появления устойчивых вариантов. Чувствительными к противотуберкулезным препаратам считаются те микобактерии туберкулеза, на которых препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие, независимо от вне- или внутриклеточного их расположения.
В соответствии с этим, критерии чувствительности микобактерий туберкулеза зависят от концентрации противотуберкулезного препарата в очаге поражения, величины максимальной терапевтической дозы препарата, его фармакокинетики. Чувствительность микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам измеряется минимальной концентрацией препарата, задерживающей рост микобактерий при стандартных условиях постановки опыта. Деление микобактерий туберкулеза на чувствительные и устойчивые производится на основании критериев, установленных клинико-лабораторными исследованиями (табл.5).
Таблица 4
Идентификация кислотоустойчивых микобактерий бактериологическими
и биохимическими тестами
---------------------T---------------------------------------------------
Тесты ¦ Микобактерии
+-----------------T---------------------------------
¦ Туберкулезн. ¦ Атипичные
+--------T--------+---------------T----------------T
¦M.tuber-¦M.bovis ¦ I группа ¦ II группа ¦
¦culosis ¦ +-------T-------+-------T--------+
¦ ¦ ¦M.kan- ¦M.mari-¦M.scro-¦M.gordo-¦
¦ ¦ ¦sasii ¦num ¦fulace-¦nae ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦um ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
---------------------+--------+--------+-------+-------+-------+--------+
Скорость роста Медл. Медл. Медл. Медл. Медл. Медл.
Ниацин + - - - - -
Образование пигмента
в темноте - - - - + +
Образование пигмента
на свету - - + + - -
Каталазная активность + + + + + +
Пероксидазная актив-
ность + + - - - -
Термостабильность ка-
талазы 68° - - + + +
Гидролиз твина-80 -/+ - + + - +
Восстановление нитра-
тов + - + - - -
Уреаза + + + + + -/+
Никотинамидаза + - + + + -
Пиразинамидаза + -/+ -/+ + + -
Рост на среде с 5%
NaCl - - - - - -
Рост на среде с 500
мкг/мл салицил. нат-
рия - - +/- +/- + +
Рост на среде с 500
мкг/мл паранитробенз.
кислоты - - +/- +/- + +
Рост на среде с 2
мкг/мл тибона - - - - + +
Образование корд-фак-
тора + + -/+ -/+ - -
Рост на среде Лев.
Иен. 22-25°С - - +/- + + +
То же 37-38°С + + + +/- + +
То же 45°С - - - - - -
Рост на агаре 22°С - - - - -/+ +/-
То же 37°С - - - - +/- +/-
---------------------T--------------------------------------------------¬
Тесты ¦ Микобактерии ¦
+--------------------------------------------------+
¦ Атипичные ¦
+-----------------------------T--------------------+
¦ III группа ¦ IV группа ¦
¦-----T-----T-----T-----T-----+------T------T------+
¦M.av-¦M.in-¦M.xe-¦M.te-¦M.tr-¦M.for-¦M. ¦M.sme-¦
¦ium ¦tra- ¦nopi ¦rrae ¦ivia-¦tuitum¦phlei ¦gmatis¦
¦ ¦cel- ¦ ¦ ¦le ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦lula-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦re ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
---------------------+-----+-----+-----+-----+-----+------+------+-------
Скорость роста Медл. Медл. Медл. Медл. Медл. Быстр. Быстр. Быстр.
Ниацин - - - - - - - -
Образование пигмента
в темноте - - -/+ - - - + -/+
Образование пигмента
на свету - - - - - - - -
Каталазная активность + + + + + + + +
Пероксидазная актив-
ность - - - - - - - -
Термостабильность ка-
талазы 68° + + + + + + +
Гидролиз твина-80 - - - + + +/- + +
Восстановление нитра-
тов - - - + + + + +
Уреаза - - - - - +/- + +
Никотинамидаза + + + -/+ - +/- + +
Пиразинамидаза + + + -/+ - +/- + +
Рост на среде с 5%
NaCl - - - - + + + +
Рост на среде с 500
мкг/мл салицил. нат-
рия +/- +/- +/- + + + + +
Рост на среде с 500
мкг/мл паранитробенз.
кислоты +/- +/- +/- + + + + +
Рост на среде с 2
мкг/мл тибона + + + + + + + +
Образование корд-фак-
тора - - - - - - - -
Рост на среде Лев.
Иен. 22-25°С -/+ +- - + + + + +
То же 37-38°С + + + + + + + +
То же 45°С +- -+ -/+ - - - + +
Рост на агаре 22°С - - - - - + + +
То же 37°С - - - - - + + +
Обозначения:
Для роста на среде:
+ рост всех культур
- рост отсутствует
+/- не все культуры дают рост
-/+ большинство культур не дает роста
реакция положительная
Для образования пигмента:
+ культуры образуют пигмент
- культуры не образуют пигмент
-/+ отдельные культуры образуют
пигмент
Для биохимических реакций:
+ реакция отрицательная
- реакция положительная
+/- не все культуры дают положительную реакцию
-/+ не все культуры дают отрицательную реакцию
Во фтизиатрической практике приняты условные понятия "первичной" и "вторичной" устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. "Первичной" устойчивостью микобактерий считают устойчивость, которая была определена у микобактерий, выделенных от больных, не принимавших противотуберкулезных препаратов. "Вторичной" устойчивостью микобактерий считается устойчивость микобактерий, выделенных от больных в процессе лечения противотуберкулезными препаратами. Эти понятия введены для обоснования различного подхода к лечению больных.
Определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза в настоящее время может проводиться бактериологическими методами - методом разведений в плотной питательной среде и методом разведений в жидкой питательной среде. Имеются модификации обоих методов.
Таблица 5
Критерии устойчивости микобактерий туберкулеза
к противотуберкулезным препаратам
--------------------------------------T----------------------------------
Препарат ¦ Микобактерии устойчивы при росте
¦ на среде, содержащей препарат
¦ в концентрации (в мкг/мл)
--------------------------------------+----------------------------------
Стрептомицин 5
Изониазид 1
ПАСК 1
Этионамид 30
Протионамид 30
Циклосерин 50
Теризидон 50
Канамицин 30
Виомицин 30
Тиоацетазон (тибон) 2
Этамбутол 2
Рифампицин 20
Примечание. Определение лекарственной чувствительности проводится на плотной среде Левенштейна-Иенсена.
Модификации метода определения лекарственной чувствительности в жидкой среде представлены методом глубинного посева микобактерий и методом микрокультивирования на стеклах. Методы определения чувствительности микобактерий в жидких средах более трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, их окраски и микроскопирования, требуют соблюдения большей стерильности. Однако, результаты определения получают в более короткие сроки (от 12 до 24 дней). Метод микрокультивирования на стеклах и метод глубинного посева применяются для прямого определения чувствительности микобактерий непосредственно из патологического материала. При этом в патологическом материале должно содержаться не менее 1-5 микобактерий в поле зрения.
Модификации метода определения лекарственной чувствительности в плотной среде представлены методом абсолютных концентраций и методом пропорций. Эти методы менее трудоемки, позволяют использовать патологический материал, содержащий любое количество микобактерий, поскольку определение может проводиться у предварительно выделенных из патологического материала микобактерий. Это обстоятельство удлиняет сроки получения результатов. Определение чувствительности при этом производится путем засева дозированного количества микобактерий, что позволяет более точно определить степень их чувствительности.
Выбор метода зависит от цели исследования и от возможностей лаборатории, выполняющей исследование. В качестве унифицированного метода рекомендуется определение чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам методом разведения в плотной среде Левенштейна-Иенсена (метод абсолютных концентраций), как менее трудоемкий и более простой.
Этот метод достаточно точен, наиболее прост и доступен для практических лабораторий. Среда, применяемая в этом методе, принята Всемирной организацией здравоохранения за международный стандарт среды для определения чувствительности микобактерий туберкулеза к лекарственным препаратам.
4.2. Определение чувствительности микобактерий туберкулеза
к противотуберкулезным препаратам методом абсолютных концентраций
на плотных средах
Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на средах с различным содержанием препаратов.
Приготовление суспензии культуры. Выросшую на плотной питательной среде культуру снимают платиновой лопаткой или петлей и помещают в фарфоровую ступку или в стеклянную пробирку. Растирают пестиком в ступке или стеклянной палочкой в пробирке в течение 4-5 минут, постепенно добавляя стерильный физиологический раствор. Суспензию культуры стандартизируют по бактериальному стандарту мутности - 500 млн. микробных тел в миллилитре (5 единиц), затем разводят физиологическим раствором 1:10.
Приготовление плотной питательной среды. В яичную среду Левенштейна-Иенсена, не содержащую крахмала (крахмал адсорбирует лекарственные препараты), до свертывания добавляют различные разведения противотуберкулезных препаратов. Разведения препаратов готовят из порошкообразных лекарственных форм непосредственно перед использованием.
В соответствии с критериями чувствительности, при постановке опытов на плотных питательных средах рекомендуется пользоваться следующими концентрациями туберкулостатических препаратов:
стрептомицин - 5, 10, 50 мкг/мл
изониазид - 1, 5, 25 "
ПАСК - 1, 5 "
этионамид - 30, 50 "
протионамид - 30, 50 "
циклосерин - 30, 50 "
теризидон - 30, 50 "
виомицин - 30, 50 "
канамицин - 30, 50 "
тиоацетазон (тибон) - 2, 5 "
рифампицин - 20, 50 "
этамбутол - 2, 5 "
Расчет препаратов производится на 100 мл среды.
Примечание. Предложенные при концентрации стрептомицина и изониазида позволяют получить более точные сведения, что, соответственно, позволит клиницистам лучше ориентироваться при выборе тактики лечения больных.
Разведение противотуберкулезных препаратов
Стрептомицин. Для определения лекарственной чувствительности к стрептомицину используют дигидрострептомицинсульфат. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода.
1-е разведение - 100.000 ед/мл: 200.000 ед. стрептомицина + 2 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 5.000 ед/мл: 1 мл 1-го разведения + 19 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 1.000 ед/мл: 1 мл 2-го разведения + 4 мл дистиллированной воды.
4-е разведение - 500 ед/мл: 2 мл 3-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
После добавления в 99 мл среды 1 мл 2-го, 3-го или 4-го разведений стрептомицина получают концентрации препарата в среде - 50, 10 и 5 ед/мл.
Изониазид. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода.
1-е разведение - 2500 мкг/мл: 15 мг изониазида + 6 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 500 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 4 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 4 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл каждого из разведений изониазида получают концентрации препарата в средах - 25, 5 и 1 мкг/мл.
ПАСК. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода. Расчет препарата производят по парааминосалициловой кислоте (ПАСК). 14 г натриевой соли ПАСК соответствуют 10 г чистой ПАСК.
1-е разведение - 1000 мкг/мл: 14 мг ПАСК + 10 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 500 мкг/мл: 3 мл 1-го разведения + 3 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 4 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го или 3-го разведений ПАСК получают концентрации препарата в среде - 5 и 1 мкг/мл.
Этионамид. Навеску растворяют в этиловом спирте, последующие разведения делают в стерильной дистиллированной воде.
1-е разведение - 10.000 мкг/мл: 50 мг этионамида + 5 мл спирта.
2-е разведение - 5.000 мкг/мл: 3 мл 1-го разведения + 3 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 3.000 мкг/мл: 3 мл 2-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го или 3-го разведения этионамида получают концентрации препарата в среде - 50 и 30 мкг/мл.
Разведение протионамида делают по такой же схеме.
Циклосерин. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода.
1-е разведение - 5.000 мкг/мл: 20 мг циклосерина + 4 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 3.000 мкг/мл: 3 мл 1-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл каждого из разведений циклосерина получают концентрации препарата в среде - 50, 30 мкг/мл.
Разведение теризидона делают по такой же схеме. При этом растворителем препарата служит стерильный 10% раствор фосфорнокислого натрия.
Канамицин. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода.
1-е разведение - 100.000 мкг/мл: 20 мг канамицина + 2 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 5.000 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 19 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 3.000 мкг/мл: 3 мл 2-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го или 3-го разведения канамицина получают концентрацию в среде - 50, 30 мкг/мл.
Разведение виомицина проводят по такой же схеме.
Тиоацетазон (тибон). Навеску растворяют в этиловом спирте, а последующие разведения делают в стерильной дистиллированной воде.
1-е разведение - 1.000 мкг/мл: 10 мг тиоацетазона + 10 мл спирта.
2-е разведение - 500 мкг/мл: 2 мл 1-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 200 миг/мл: 2 мл 2-то разведения + 3 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го или 3-го разведений тиоацетазона получают концентрации препарата в среде - 5 и 2 мкг/мл.
Рифампицин. Навеска растворяется в этиловом спирте, последующие разведения делают в стерильной дистиллированной воде.
1-е разведение - 10.000 мкг/мл: 150 мг рифампицина + 15 мл спирта.
2-е разведение - 5.000 мкг/мл: 3 мл 1-го разведения + 3 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 2.000 мкг/мл: 2 мл 2-го разведения + 3 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го и 3-го разведений препарата получают концентрации в среде - 50 и 20 мкг/мл.
Этамбутол. Растворителем служит стерильная дистиллированная вода.
1-е разведение - 1.000 мкг/мл: 10 мг этамбутола + 10 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 500 мкг/мл: 2 мл 1-го разведения + 2 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 200 мкг/мл: 2 мл 2-го разведения + 3 мл дистиллированной воды.
После добавления к 99 мл среды 1 мл 2-го или 3-го разведения препарата получают концентрации в среде - 5 и 2 мкг/мл.
Ход исследования. Питательную среду с различными концентрациями противотуберкулезных препаратов разливают в пробирки по 5 мл и свертывают в наклонном положении в течение 45 минут при температуре 85°С, не допуская перегрева среды. Рекомендуется проводить свертывание среды в электросвертывателе с автоматической регулировкой температуры. Среду с противотуберкулезными препаратами можно хранить в холодильнике при температуре 2-4°С не более 1-2 месяцев. Хранение сред при комнатной температуре недопустимо.
Пробирки с приготовленными средами, содержащими противотуберкулезные препараты, и одну контрольную пробирку со средой, не содержащей препаратов, засевают приготовленной взвесью культуры, по 0,2 мл в каждую пробирку (см. выше). Пробирки парафинируют или закрывают резиновыми пробками и помещают в наклонном положении в термостат при 37°С.
Пробирки вынимают из термостата через 3 недели после засева и регистрируют полученные результаты. При скудном росте в контроле пробирки ставят еще на неделю в термостат, после чего дают окончательный ответ.
Оценка результатов. Культура считается чувствительной, если в пробирке со средой, содержащей препарат, выросло менее 20 колоний при обильном росте в контроле. Только при наличии более 20 колоний культура расценивается как устойчивая к той концентрации препарата, которая содержится в среде.
При любом методе определения чувствительности микобактерий к противотуберкулезным препаратам необходимо каждую серию приготовленной питательной среды с препаратами проверить, засевая заведомо чувствительной культурой микобактерий туберкулеза. Для контроля можно пользоваться чувствительным штаммом H37Rv или любой тщательно проверенной чувствительной культурой микобактерий туберкулеза. Контрольная культура засевается так же, как испытуемая.
Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препарата, при котором не растут чувствительные к лекарственным препаратам штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке даже с наименьшей концентрацией препарата указывает на допущение ошибок при приготовлении среды с препаратами или на неправильное приготовление бактериальной суспензии.
4.3. Определение чувствительности микобактерий к нескольким
противотуберкулезным препаратам
Известно, что бактериальная популяция, выделенная из патологического материала, часто содержит смесь устойчивых и чувствительных микобактерий. Кроме того, она может содержать особи с неодинаковой степенью устойчивости к одному или к нескольким лекарственным средствах, а также микобактерий с двойной резистентностью и полирезистентностью.
Определение чувствительности микобактерий туберкулеза, как правило, проводится раздельно к каждому противотуберкулезному препарату. Устойчивость культуры к двум или нескольким препаратам может быть обусловлена несколькими причинами: либо все микробные особи данной культуры устойчивы к двум препаратам (для них введен термин "истинная" двойная устойчивость), либо культура состоит из смеси микробных особей, из которых одна часть устойчива к одному препарату, а другая - к другому (для этой категории культур введен термин "ложная" двойная устойчивость).
Для определения "истинной" и "ложной" двойной устойчивости микобактерий туберкулеза был предложен метод перекрестных посевов и посевов бактерий на смеси препаратов, к которым была определена двойная устойчивость. При определении лекарственной чувствительности микобактерий к смеси препаратов устойчивую культуру засевают в пробирку со средой, содержащей те концентрации препаратов которые определяют критерии устойчивости. Например, смесь 5 мкг/мл стрептомицина и 1 мкг/мл изониазида.
При методе перекрестных посевов культуру, выросшую на плотной среде, содержащей стрептомицин, пересевают на среду, содержащую изониазид. Культуру, выросшую на среде с изониазидом, пересевают на среду, содержащую стрептомицин. Например:
-----------------------------------------T-------------------------------
Лекарственная устойчивость ¦ Препараты в среде
микобактерий +----------------T--------------
¦ стрептомицин ¦ изониазид
¦ 50 мкг/мл ¦ 1 мкг/мл
-----------------------------------------+----------------+--------------
+ -------¬ ----> +
Двойная "истинная" --+--
+ ------ L-----> +
+ -------¬ ----> +
Двойная "ложная" --+--
- ------ L-----> -
Примечание: + рост микобактерий
- отсутствие роста микобактерий
---¬ -->
--+-- - перекрестный пересев культур
-- L--->
При "истинной" двойной устойчивости культура микобактерий растет на средах, содержащих раздельно оба препарата и смесь этих препаратов.
При "ложной" двойной устойчивости культура не растет на средах с противоположными препаратами и с их смесью.
4.4. Определение концентрации туберкулостатических препаратов
в крови больных туберкулезом
Экспериментальные исследования и клинические наблюдения показали, что имеется четкая зависимость лечебного действия туберкулостатических препаратов от их концентрация в крови. В свою очередь, уровень бактериостатически активного препарата в крови и в очагах поражения зависит от физико-химических свойств лекарства, условий его всасывания, распределения, биотрансформации и скорости элиминации. Большое значение имеет также доза препарата, метод введения и комбинации его с другими туберкулостатическими средствами. Поэтому определение фармакокинетики препарата в крови больного может помочь клиницистам в прогностической оценке эффективности терапии, уточнении ее тактики, способа введения препарата, его оптимальных дозировок и наиболее эффективных комбинаций препаратов. Рационально параллельное определение концентрации препарата в крови больного и определение чувствительности выделенных микобактерий туберкулеза к туберкулостатическим препаратам. Сопоставление результатов этих определений может подсказать клиницистам более правильную тактику дальнейшего лечения больного.
Определение концентрации в крови применяемых в клинике туберкулостатических препаратов проводится двумя методами - микробиологическим и химическим. В некоторых случаях более целесообразно использовать химический метод. Это относится к циклосерину и к его гомологу - теривалидину (или теризидону), пиразинамиду и к его гомологуморфазинамиду. Концентрацию в крови остальных препаратов (изониазид и препараты из группы гидразидов изоникотиновой кислоты, ПАСК, этионамид и протионамид, этоксид, изоксил, тибон, - стрептомицин, канамицин, виомицин, капреомицин, рифампицин) рационально определять микробиологическим методом, так как последний позволяет определять не только неизмененный препарат, но и всю совокупность метаболитов, обладающих бактериостатической активностью, которую, в большинстве случаев, невозможно определить химическими методами.
При использовании микробиологического метода в качестве тест-микроба применяют как микобактерии туберкулеза, так и бактерии других видов, чувствительные к противотуберкулезным препаратам. Для определения концентрации изониазида (и других препаратов группы ГИНК), ПАСК, этионамида, протионамида, этоксида, изоксила, тиоацетазона, этамбутола и рифампицина используют микобактерии туберкулеза.
Для определения концентрации таких антибиотиков широкого спектра, как стрептомицин, канамицин, виомицин, капреомицин, применяется микробиологический метод диффузии в агар с использованием в качестве тест-микробов Вас. subtilis 6633 (гладкая форма), Staph. aureus в соответствии с государственной фармакопеей X, 1958, 209 и др.
4.4.1. Определение концентрации противотуберкулезных препаратов
в крови больных методом серийных разведений в жидкой среде
Принцип. Приготовление серийных разведений образца крови больных, получавших противотуберкулезные препараты, в жидкой питательной среде с последующим внесением в каждое разведение дозированного количества тест-микробов. После периода инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микобактерий. Метод позволяет определить максимальное разведение крови, задерживающее рост тест-микробов с известной чувствительностью к данному препарату. Концентрация препарата в крови вычисляется умножением показателя разведения крови на концентрацию препарата в пробирке, определяющего чувствительность тест-штамма в контрольном опыте.
Компоненты.
1. Питательная среда для микобактерий (Школьниковой):
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5 г
Калий фосфорнокислый двузамещенный - 2,5 г
Сернокислая магнезия - 0,5 г
Лимоннокислый натрий - 1,5 г
Лимонно-аммиачное железо - 0,05 г
Гидролизат казеина - 80 мг или L-аспарагин - 1 г
Глицерин - 30 мл
Дистиллированная вода - 890 мл
После стерилизации pH - 6,8-7,0.
2. Плазма человеческой крови. Добавляется к среде Школьниковой непосредственно перед употреблением.
3. Лимоннокислый натрий, 6%.
4. Противотуберкулезный препарат в порошкообразной форме (для контрольных опытов).
5. Этиловый спирт.
Подготовка к определению. Определение производят в центрифужных пробирках, размещенных в штативе по 10, в 2 ряда. Во все пробирки, кроме первой первого ряда, являющегося основным рабочим рядом, и во все пробирки второго ряда (контрольного), служащего для определения минимальной бактериостатической концентрации препарата по отношению к тест-штамму "Академия", разливают по 2 мл среды Школьниковой с 10% плазмы человеческой крови.
Для контрольного ряда готовят разведения противотуберкулезных препаратов согласно представленным ниже схемам. Для получения серии необходимых концентраций каждого из препаратов в первую пробирку контрольного ряда наливают 2 мл исходного рабочего разведения препарата. Ряд серийных разведений получают, перенося последовательно из каждой пробирки по 2 мл жидкости в следующую.
Схемы разведения противотуберкулезных препаратов
1. Изониазид.
1-е разведение - 360 мкг/мл: 9 мг изониазида + 25 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 36 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 3,6 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
4-е разведение - 1,8 мкг/мл: 2 мл 3-го разведения + 2 мл среды Школьниковой (исходное рабочее разведение).
Серия концентраций контрольного ряда для изониазида: 0,9; 0,45; 0,22; 0,11; 0,05; 0,025, 0,012; 0,006; 0,003 мкг/мл.
2. ПАСК
1-е разведение - 1000 мкг/мл: 14 мг ПАСК + 10 мл дистиллированной воды (14 мг натриевой соли ПАСК соответствуют 10 мг чистой ПАСК).
2-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 20 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 4 мл среды Школьниковой (исходное рабочее разведение).
Серия концентраций контрольного ряда для ПАСК: 5; 2,5; 1,25; 0,62; 0,31; 0,16; 0,08; 0,04 мкг/мл.
3. Этионамид.
1-е разведение - 10 000 мкг/мл: 0,25 г этионамида + 25 мл этилового спирта.
2-е разведение - 1000 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
4-е разведение - 10 мкг/мл: 1 мл 3-го разведения + 9 мл среды Школьниковой (исходное рабочее разведение).
Серия концентраций контрольного ряда для этионамида: 5; 2,5; 1,25; 0,62; 0,31; 0,016; 0,008; 0,004; 0,002 мкг/мл.
4. Рифампицин (рифадин).
1-е разведение - 10 000 мкг/мл: 150 мг рифампицина + 5 мл этилового спирта + 10 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 1000 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
4-е разведение - 25 мкг/мл: 1 мл 3-го разведения + 3 мл среды Школьниковой (исходное рабочее разведение).
Серия концентраций контрольного ряда для рифампицина: 12,5; 6,25; 3,125; 1,562; 0,781; 0,39; 0,19; 0,095; 0,047 мкг/мл.
5. Этамбутол.
1-е разведение - 1.000 мкг/мл: 4 мг этамбутола + 3 мл дистиллированной воды.
2-е разведение - 100 мкг/мл: 1 мл 1-го разведения + 9 мл дистиллированной воды.
3-е разведение - 25 мкг/мл: 1 мл 2-го разведения + 3 мл среды Школьниковой (исходное рабочее разведение).
Серия концентраций контрольного ряда для этамбутола: 12,5; 6,25; 3,125; 1,562; 0,781; 0,39; 0,19; 0,095; 0,047 мкг/мл.
Ход определения. Если исследование проводится в период лечения больного, то за двое суток до определения концентрации препарата у больного отменяются все антибактериальные средства. В день исследования больному утром, натощак, дают тест-дозу препарата (обычно - разовую терапевтическую дозу). Через 2 часа (после введения изониазида, ПАСК, рифампицина, этамбутола и др.) или через 3-6 часов (после введения этионамида) из локтевой вены берут кровь в количестве 4 мл и помещают в стерильную пробирку, содержащую 2 мл стерильного 5% раствора лимонно-кислого натрия в качестве антикоагулянта. Все содержимое пробирки точно измеряют и добавляют столько среды Школьниковой, чтобы получить разведение крови в 2 раза. В 1-ю и 2-ю пробирки 1-го, основного, рабочего ряда наливают по 2 мл крови, разведенной 1:2, получая, тем самым, во второй пробирке разведение 1:4. Затем готовят ряд последовательных двукратных разведений крови, перенося по 2 мл жидкости в каждую последующую пробирку. Получают разведение крови 1:8 (в третьей пробирке) до 1:512 (в девятой пробирке). Из 9-й пробирки 2 мл жидкости удаляют. 10-я пробирка содержит питательную среду Школьниковой без испытуемой крови.
В 1-ю пробирку контрольного (второго) ряда вносят 2 мл раствора исследуемого препарата, содержащего его исходное рабочее разведение (см. схемы разведения препаратов). Далее, перенося последовательно из каждой пробирки по 2 мл жидкости в следующую, получают серийные концентрации препарата в контрольном ряду. Десятая пробирка не содержит препаратов и является контрольной. В качестве тест-микроба используется взвесь микобактерий туберкулеза штамма "Академия" или других микобактерий, чувствительных к противотуберкулезным препаратам. Во все опытные и контрольные пробирки засевают по 0,2 мл взвеси микобактерий штамма "Академия", приготовленной по стандарту мутности N 5 (500 млн. микробных тел в 1 мл). Пробирки парафинируют и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 10 дней. По истечении этого срока из образовавшихся на дне пробирки осадков готовят мазки, которые окрашиваются по Цилю-Нильсену.
Оценка результатов. Результаты учитываются по интенсивности косообразования при микроскопии мазков. Картину роста в среде с различными разведениями крови сравнивают с ростом в контрольной пробирке, содержащей питательную среду без препарата, где обычно определяется сплошной рост микобактерий в виде "кос". В мазках, приготовленных из осадков содержимого опытных пробирок, культуру оценивают как растущую не только по наличию в мазке множества микобактерий (+++), но также по наличию изолированных "кос" в каждом поле зрения (++). Задержкой роста считается наличие в мазке единичных изолированных мелких микроколоний (-). О бактериостатической активности крови судят на основании задержки роста микобактерий в пробирке с наибольшим ее разведением. Зная, на основании контроля, минимальную бактериостатическую активность препарата по отношению к тому же штамму, умножением этих величин вычисляют концентрацию препарата в крови. Пример: (Таблица 6).
Таблица 6
---------------------T---------------------------------------------------
¦ Пробирки NN
+---T----T----T----T----T-----T-----T-----T-----T---
¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦ 10
---------------------+---+----+----+----+----+-----+-----+-----+-----+---
Разведение изониазида
в мкг/мл (контрольный
ряд) 0,9 0,45 0,22 0,11 0,05 0,025 0,012 0,006 0,003 К
Результат - - - - - - + ++ ++ +++
Разведение крови 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 К
Результат - - - + ++ ++ +++ +++ +++ +++
Обозначения: - отсутствие роста микобактерий
+ рост микобактерий туберкулеза
В приведенном примере рост "культуры микобактерий в контроле не отмечают при содержании 0,025 мкг/мл изониазида, а в крови - при разведении 1:8. Следовательно, содержание изониазида в цельной крови равно 0,025 мкг/мл х 8 = 0,2 мкг/мл.
Примечание:
1. В методике определения концентрации противотуберкулезных препаратов в крови больных методом серийных разведений приводятся схемы разведений наиболее распространенных в клинической практике противотуберкулезных препаратов.
2. B качестве тест-штамма для засева предложен штамм микобактерий "Академия", наиболее чувствительный ко всем исследуемым противотуберкулезным препаратах (его МИК для изониазида составляет 0,025 мкг/мл, для этионамида - 0,03-0,05 мкг/мл, для этамбутола - 0,78 мкг/мл). Штамм "Академия" невирулентен, но сохраняет способность косообразования в жидкой питательной среде.
3. В методике указывается различное время взятия крови у больных для определения концентрации препарата. Оно обусловлено особенностями фармакокинетики каждого препарата. Максимальный уровень препарата в крови больного отмечается для изониазида, ПАСК, рифампицина и этамбутола на 2-м часу после приема лекарства перорально, для этионамида - на 3-6 часу после приема.
4. В связи с широким антибактериальным спектром действия рифампицина, для определения его концентрации в биологических жидкостях можно применять чашечный метод диффузии в агар с использованием в качестве тест-микроба staph aureus 209 Р, чувствительного к 0,05 мкг/мл препарата и среды Хеттингера с глюкозой (0,1%) с содержанием аминного азота 130-140 мг %. Описание определения "концентрации препарата в крови методом диффузии в агар приведено при описании определения концентрации стрептомицина.
4.4.2 Определение концентрации стрептомицина в крови больных
методом диффузии в агар
Принцип. Определение концентрации стрептомицина производится методом диффузии в агаровую среду, зараженную микроорганизмом, чувствительным к стрептомицину. При этом методе активность испытуемой сыворотки определяется величиной зоны угнетения роста тест-микроба и сравнением ее с размером зон, полученных при диффузии стандартного раствора стрептомицина.
Компоненты.
1. Среда (основная):
Бульон Хоттингера, содержащий 30-35 мг % аминного азота - 1.000 мл.
Двузамещенный фосфат натрия - 3 г.
Хлористый магний (насыщенный раствор) - 95 мл.
Агар - 15 г.
pH - 7,8-8,0 (после стерилизации).
Если в лаборатории нет высокоочищенного агара (типа "Дифко"), нужно перед употреблением агар очищать. Очистка агара производится следующим образом: отвешивают необходимое количество агара, помещают в марлевые мешочки и промывают проточной водопроводной водой в течение 18-24 часов, затем трижды промывают дистиллированной водой.
2. Стандартные растворы стрептомицина. Первоначально готовят основной раствор стандарта (1.000 ед/мл) в дистиллированной воде. Основной раствор стрептомицина может храниться в холодильнике в течение 1 месяца. Рабочий стандарт (0,2 ед/мл) разводится непосредственно перед употреблением в 1/15М фосфатном буфере pH 8.
3. 1/15М фосфатный буфер pH 8. Делают навеску 11,88 г Na2HPO4 x 2H2O, растворяют в 1 л дистиллированной воды. 9-08 г КН2РO4 растворяют в 1 л дистиллированной воды. Смешивают 9,44 мл первого раствора и 0,56 мл второго. Получают раствор фосфатного буфера 1/15М, pH 8.
4. В качестве тест-микроба используется споровая взвесь Вас.subtilis АТСС 6633 (гладкая форма), которую вносят в среду из расчета 20.000.000 опор на 1 мл среды, нагретой до 65°С.
Готовят споровую взвесь следующим образом: тест-культуру высевают на чашки с 2% агаром, приготовленным на мясо-пептонном бульоне, разведенном физиологическим раствором 1:2 (pH - 7,0-7,2). Выращивают при 37°С в течение 18-24 часов. Отбирают типичные колонии (мелкие, сероватые, с зубчатыми краями) и пересевают на скошенный агар в пробирках (того же состава). Выращивают 18 часов при 37°С. Микроскопируют полученную культуру. В мазке, окрашенном по Граму, должны быть грам-положительные палочки с закругленными концами, располагающиеся в виде цепочек и отдельных особей. Для получения спор культуру, выросшую на скошенном мясо-пептонном агаре, пересевают на 2,5% агар на бульоне Хоттингера с 30-35 мг% аминного азота и выращивают при 37°С 5-7 суток. Когда в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают 80-90% спор, споры смывают с поверхности агара дистиллированной водой, разливают по ампулам, запаивают и хранят при +4°С. Для постановки опыта по определению концентрации готовят 1 млрдн. взвесь по оптическому стандарту мутности.
Ход исследования. В чашки Петри одинакового диаметра с ровным плоским дном разливают по 15 мл расплавленной и охлажденной до 60-70°С основной среды, в которую внесен тест-микроб в количестве 20.000.000 спор на 1 мл среды. После застывания засеянного агара на его поверхность (с помощью трафарета, подложенного под дно чашки) расставляют на одинаковом расстоянии друг от друга в 28 мм от центра чашки 6 цилиндриков из нержавеющей стали. Высота их - примерно 10 мм, наружный диаметр - 8 мм, внутренний - 6 мм. Вместо цилиндриков в среде с помощью стерильного бора или этих же цилиндриков могут быть сделаны лунки диаметром 8 мм.
В 3 цилиндрика или лунки каждой чашки одновременно вносят по 0,1 мл указанных разведений стандартного препарата и в 3 цилиндрика или лунки - одно из разведений (1:10, 1:20, 1:50 или 1:100) испытуемых биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи и т.п.) в зависимости от ожидаемой концентрации препарата в этом материале. Чашки выдерживают 2 часа при комнатной температуре; за это время антибиотик диффундирует в агар. Затем чашки инкубируют при 37-38°С в течение 18-24 часов.
Оценка результатов. Измеряют диаметры зон угнетения роста тест-микроба, образуемых испытуемыми разведениями биологических жидкостей и стандарта стрептомицина с возможно большей точностью.
Расчет концентрации антибиотика производят по:
а) стандартной (калибровочной) кривой;
б) по таблице ВНИИА (таблица В.С.Дмитриевой)**.
а) Построение стандартной кривой
Для построения стандартной кривой используют 5 концентраций стрептомицина - 0,1; 0,14; 0,2; 0,25; 0,3 ед/мл. Концентрация 0,2 ед/мл является контрольной (опорной). Применяемые для построения кривой концентрации не должны отличаться от контрольной концентрации более, чем на 50%.
Заготовляют 12 чашек Петри с 6 лунками или цилиндриками. Для каждой концентрации используют 3 чашки Петри. В 3 лунки каждой чашки помещают одну из концентраций стандарта. Следовательно, каждое разведение стандарта помещают в 9 лунок чашек. Контрольную концентрацию стандарта (0,2 мкг/мл) помещают в оставшиеся свободными 3 лунки всех 12 чашек. Чашки помещают в термостат при 37°С на 18 часов и затем измеряют зоны задержки роста тест-микроба. После измерения зон задержки роста для каждой концентрации выводят среднюю величину зоны (из 9-ти измерений величины зоны) и среднюю величину зоны для контрольной концентрации (из 36-ти измерений величины зоны).
По разности между средней величиной зоны контрольной концентрации, полученной из всех чашек, и средней величиной зоны контрольной концентрации, полученной при измерении 9-ти зон в 3-х чашках для каждой отдельной концентрации стандарта, находят поправку к величине каждой концентрации. Найденную поправку прибавляют или вычитают (в зависимости от знака) из средней величины зоны данной концентрации.
Например: средняя величина зоны для контрольной концентрации - 0,2 мкг/мл - по 36 измерениям равна 19,2 мм. Средняя величина зоны для этой концентрации на 3-х чашках, где одновременно помещались концентрации 0,15 мкг/мл, составляет 19 мм. Следовательно, величина поправки для средней величины зон, образуемых 0,15 мкг/мл, будет +0,2 мм. Если средняя зона от 0,15 мкг/мл равна 17,9 мм, то ее следует исчислять - 18,1 мм. Аналогичным образом поправляют значение средней величины зоны для каждой концентрации.
По средней величине зоны 0,2 мкг/мл, полученной из 36-ти измерений, и исправленным значениям средних величин зон остальных концентраций строят стандартную кривую на полулогарифмической сетке для расчета активности антибиотиков. На оси абсцисс откладывают величины зон, на оси ординат - соответствующие им концентрации препаратов.
Если условия опыта остаются неизмененными, стандартной кривой можно пользоваться некоторое время, проверяя угол наклона по 2-м точкам - двум концентрациям стандарта на 3-х чашках. При смене партии среды или стандартного раствора стрептомицина следует проводить повторную калибровку и построение стандартной кривой.
При определении концентрации антибиотика в биологических жидкостях по стандартной кривой измеряют зоны задержки роста тест-микроба, образованные различными разведениями этих биологических жидкостей. Причем, разведения биологических жидкостей (1:20; 1:50; 1:100; 1:500) вносят в три лунки или в три цилиндрика каждой чашки, а в остальные 3 - вносят такое же количество контрольного разведения стандарта. В качестве исходной берут концентрацию того разведения биологической жидкости, которое дает зону, близкую к зоне контрольной концентрации препарата. Полученное значение концентрации препарата в данном разведении умножают на разведение и получают значение концентрации препарата в цельной сыворотке крови, моче или в другой биологической жидкости.
б) Расчет концентрации антибиотика по таблицам ВНИИА (таблицы В.С.Дмитриевой).
При расчете активности по таблицам ВНИИА также готовят разведения биологической жидкости и контрольную концентрацию стандарта препарата. Принцип таблиц основан на том, что в полулогарифмических координатах угол наклона стандартной кривой обусловлен разностью диаметров зон задержки роста при разведении препарата вдвое. В таблицах условно принято, что 1 ед/мл препарата дает зону задержки роста = 17 мм. Поэтому к средней величине зон задержки роста стандартным раствором вносят соответствующую поправку.
На каждую разность диаметров зон испытуемой жидкости и контрольного раствора (от 1 мм до 5 мм) имеется соответствующая таблица. Всего - 41 таблица с разницей по диаметру зон 0,1 мм.
Практически для расчета концентрации препарата в биологических жидкостях (сыворотки крови, мочи и т.п.) по таблицам готовят не менее 2-х разведений испытуемой жидкости. Концентрация каждого последующего разведения должна быть в 2 раза слабее предыдущего. Например: 1:100, 1:200, 1:400. Следует делать разведения так, чтобы получать концентрации препарата, близкие к опорной (0,2 ед/мл для стрептомицина). Чем ближе концентрация препарата в биологической жидкости к опорной, тем точнее будет установлена концентрация его в испытуемой жидкости. На каждое разведение биологической жидкости используют не менее 2-х чашек.
На каждой чашке по трафарету расставляют 6 цилиндриков или вырезают 6 лунок. В три лунки (через одну) закапывают одно из разведений испытуемой жидкости; в остальные три лунки - такое же количество контрольного раствора стандарта (0,2 ед/мл). После инкубации в термостате измеряют миллиметровой бумагой или линейкой диаметры зон задержки роста и подсчитывают средне-арифметическую величину диаметров зон для испытуемых биологических жидкостей и контрольного раствора стандарта.
Результаты измерения зон записывают по следующей форме:
Пример формы записи измерения зон
-------------------------------T-----------------------------------------
NN чашек ¦ Диаметр зон задержки роста в мм
+----------T---------T----------T---------
¦Испытуемое¦Стандарт-¦Испытуемое¦Стандарт-
¦разведение¦ный раст-¦разведение¦ный раст-
¦ сыворотки¦вор в 0,2¦сыворотки ¦вор в 0,2
¦ 1:100 ¦ ед/мл ¦ 1:200 ¦ ед/мл
-------------------------------+----------+---------+----------+---------
20,0 16,5 16,0 16,0
I 20,0 16,5 16,0 16,0
19,5 16,5 16,5 16,0
В среднем 19,8 16,5 16,1 16,0
-------------------------------------------------------------------------
19,0 16,0 17,5 16,5
II 19,0 16,0 17,0 16,5
19,0 16,0 16,5 16,5
В среднем 19,0 16,0 17,0 16,5
-------------------------------------------------------------------------
Определение поправки
----------------------T--------T------------T--------T-------------------
Разведение ¦NN чашек¦Диаметр зоны¦Поправка¦Диаметр зоны после
¦ ¦ (в мм) ¦ (в мм) ¦ поправки (в мм)
----------------------+--------+------------+--------+-------------------
1:100 I 19,8 +0,5 20,3
1:100 II 19,0 +1,0 20,0
1:200 I 16,1 +1,0 17,1
1:200 II 17,0 +0,5 17,5
К средней величине зон задержки роста стандартного раствора вносят поправку по постоянной зоне таблиц В.С.Дмитриевой, равной 17 мм, что соответствует концентрации антибиотика 1 ед/мл.
После внесения поправки для среднего значения каждого разведения каждой чашки вычисляют среднеарифметическое значение из средних показателей диаметров зон параллельных чашек.
Среднеарифметическое значение из диаметров зон задержки роста двух чашек находят следующим образом:
20,3+20,1=40,4 17,1+17,5=34,6
40,4:2=20,2 мм 34,6:2=17,3 мм
Далее определяют разность диаметров зон задержки роста:
20,2 мм (разведение 1:100)
-
17,3 мм (разведение 1:200)
_________________________
2,9 мм
Находят таблицу, соответствующую данной разности диаметров зон (2,9 мм), по которой в первом вертикальном столбце находят целое число значения среднеарифметической величины диаметра зоны задержки роста для разведения сыворотки 1:100 (20 мм), а десятые доли (0,2 мм) - в верхней горизонтальной строке.
Содержание антибиотиков в 1 мл, соответствующее зоне задержки роста тест-микробов, находят в точке пересечения строк против 20 и 0,2, что составляет 2,15 ед/мл. В той же таблице находят диаметр зоны (17,3) для разведения 1:200, что соответствует концентрации 1,08 ед/мл.
Полученные данные умножают на показатель разведения:
2,15 ед/мл х 100 = 215 ед/мл
1,08 ед/мл х 200 = 216 ед/мл
При определении активности антибиотиков, у которых контрольный раствор стандарта не соответствует единице, полученные результаты увеличивают или уменьшают во столько раз, сколько единиц содержит 1 мл контрольного раствора стандартного образца.
Следовательно, концентрация антибиотика в 1 мл цельной сыворотки составляет:
для разведения 1:100 - 215 х 0,2 = 43,0
для разведения 1:200 - 216 х 0,2 = 43,2
Среднее значение концентрации стрептомицина в сыворотке крови данного образца составляет, таким образом,
(43,0+43,2):2=43,1 ед/мл
Примечание. Этим методом рекомендуется определять концентрацию канамицина, виомицина и капреомицина.
В этих случаях меняются опорные концентрации, зависящие от чувствительности тест-штамма к соответствующим антибиотикам. Например, для канамицина опорная концентрация равна 1 ед/мл, и используется та же тест-система, что и для определения концентрации стрептомицина.
Для определения концентрации других антибиотиков используются различные тест-микробы и соответственные питательные среды (Государственная фармакопея, 1, 1968).
4.5. Туберкулостатическая проба
Для оценки эффективности химиотерапии в случаях длительного выделения больными микобактерий туберкулеза и для решения вопроса о целесообразности коррекции лечения препаратами ГИНК применяется туберкулостатическая проба.
Принцип. Различная степень инактивации препаратов ГИНК в организме разных больных создает неодинаковую концентрацию активно действующего препарата в крови. Определяется соответствие концентрации препарата ГИНК в крови больного и чувствительности к этому препарату микобактерий туберкулеза, выделенных от этого же больного.
Компоненты.
1. Питательная среда Школьниковой:
Однозамещенный фосфорнокислый калий - 1,5 г
Двузамещенный фосфорнокислый калий - 2,5 г
Сернокислый магний - 0,5 г
Лимоннокислый натрий - 1,5 г
Лимонно-аммиачное железо - 0,05 г
Гидролизат казеина - 80 мг
Глицерин - 30 мл
Дистиллированная вода - 890 мл
После стерилизации pH - 6,8-7,0.
2. Нативная бычья сыворотка или плазма донора.
3. Физиологический раствор хлористого натрия.
4. Стандарт мутности.
5. Реактивы для окраски по Цилю-Нильсену (см. "Прямая бактериоскопия мазка с окраской по Цилю-Нильсену").
Специальное оборудование.
Микроскоп.
Газовая или спиртовая горелка.
Предметные стекла.
Термостат на 37°С.
Подготовка к исследованию.
1. Получение аутоштамма микобактерий туберкулеза. Исследование начинается с выделения от больного (из различного материала) микобактерий туберкулеза (см. "Культуральный метод выявления микобактерий туберкулеза"). Выросшие колонии микобактерий туберкулеза в день постановки опыта снимаются с поверхности плотной среды и суспензируются в физиологическом растворе до густоты 500 млн. микробных тел в 1 мл (по стандарту мутности).
2. Получение плазмы крови больного. За 2 дня до постановки пробы больному отменяют все противотуберкулезные препараты, кроме препаратов группы ГИНК. В день исследования утром больной получает разовую дозу препарата. Через 3 часа после приема препарата стерильно шприцем берут из вены 6 мл крови, которую выливают в пробирку с 0,6 мл 6% раствора лимоннокислого натрия и центрифугируют. Для опыта берут 2 мл плазмы.
Ход исследования. Для постановки опыта берут три разведения плазмы крови больного в среде Школьниковой (1:2, 1:4, 1:8) и контрольную пробирку с 1,8 мл среды Школьниковой и 0,2 мл нативной бычьей сыворотки или плазмы донора.
В каждую из трех опытных пробирок наливают по 2 мл среды Школьниковой. В первую пробирку добавляют 2 мл плазмы крови исследуемого больного, тщательно перемешивают и 2 мл смеси переносят во вторую пробирку. Из второй пробирки после перемешивания 2 мл смеси переносят в 3-ю пробирку, вновь перемешивают и 2 мл смеси удаляют. Таким образом получают указанные разведения плазмы крови больного.
Затем во все пробирки (опытные и контрольную) засевают по 0,2 мл суспензии культуры аутоштамма. Пробирки парафинируют и в течение 10 дней выдерживают в термостате при 37°С, после чего из осадка готовят мазки, которые держат в вытяжном шкафу при комнатной температуре до полного высыхания. Высохшие мазки фиксируют над пламенем горелки и окрашивают по Цилю-Нильсену.
Оценка результатов. Результаты оценивают по микроскопической картине роста при сопоставлении с ростом в контроле.
Культура оценивается как растущая при наличии сплошного роста или при большом количестве жгутов (кос), обнаруживаемых в каждом поле зрения (+). При наличии в мазке единичных колоний культура растущей не признается (-).
Туберкулостатическая проба считается положительной, если во всех пробирках с разведениями плазмы крови больного рост микобактерий туберкулеза отсутствует при наличии роста в контрольной пробирке.
Туберкулостатическая проба считается на грани отрицательной, если обнаружен рост микобактерий только в пробирке с разведением плазмы крови больного 1:8 или в пробирках с разведениями плазмы 1:4 и 1:8.
Туберкулостатическая проба считается отрицательной при наличии роста микобактерий во всех пробирках.
Отрицательная туберкулостатическая проба или находящаяся на грани отрицательной обусловлена или недостаточной для подавления роста микобактерий концентрацией препаратов ГИНК в крови больного или наличием устойчивости микобактерий к этому препарату или сочетанием этих двух факторов.
При отрицательной туберкулостатической пробе необходимо ставить вопрос об изменении тактики лечения данного больного.
Заместитель начальника
Главного управления лечпрофпомощи
Минздрава СССР
Л.Ф.Швецова
-------------------------------------------------------------------------
* Разработаны сотрудниками Центрального научно-исследовательского института туберкулеза МЗ СССР доктором медицинских наук Т.Н.Козулицыной и доктором медицинских наук Н.М.Макаревич и сотрудником Института экспериментальной и клинической онкологии АМН СССР доктором медицинских наук А.3.Смолянской, при участии сотрудника Всесоюзного научно-методического и контрольного центра по лабораторному делу М.Г.Москвитиной.
В обсуждении и рецензировании материалов принимали участие сотрудники следующих учреждений:
Центрального научно-исследовательского института туберкулеза МЗ СССР;
1-го Московского медицинского института им. И.М.Сеченова;
Московского научно-исследовательского института туберкулеза МЗ РСФСР.
Института акушерства и гинекологии МЗ СССР;
Московской клинической туберкулезной больницы N 1;
Московской клинической туберкулезной больницы N 3;
Центральной клинической больницы МПС СССР N 1;
Противотуберкулезного диспансера N 2 г.Москвы;
Противотуберкулезного диспансера N 4 г.Москвы.
Работа проводилась под руководством Комиссии по унификации и контролю качества клинических лабораторных методов исследования, председатель - профессор В.В.Меньшиков, научный руководитель Всесоюзного научно-методического и контрольного центра по лабораторному делу.
** В.С.Дмитриева и С.М.Семенов - Микробиологический контроль активности антибиотических препаратов. Медицина, М., 1965.
