Методические рекомендации "Использование высокочувствительных методов индикации специфических маркеров гепатитов А, В и Дельта в эпиднадзоре за вирусными гепатитами" (утв. Госкомсанэпиднадзором РФ 20 декабря 1991 г.)

Официальный текст документа с изменения и дополнениями по состоянию на 25 сентября 2006 года

1. Введение

Вирусные гепатиты включают 5 самостоятельных нозологических форм, в том числе гепатиты А, В и менее изученные: гепатит Дельта, гепатиты "ни А ни В" с фекально-оральным (гепатит Е) и парентеральным (гепатит С) механизмами передачи возбудителя.

В последние годы организован коммерческий выпуск отечественных диагностических тест-систем для определения специфических маркеров гепатитов А, В и Дельта. На этой основе необходимо совершенствовать эпидемиологический надзор за этими нозологическими формами вирусных гепатитов. Рациональное использование средств и методов специфической диагностики вирусных гепатитов в эпидемиологической практике возможно лишь при четком понимании информативности определения конкретных маркеров. Определение последних при обследовании очагов инфекции и решении других эпидемиологических задач должно осуществляться в вирусологических лабораториях территориальных центров санэпиднадзора.

2. Специфические маркеры гепатита А, их эпидемиологическое и диагностическое значение

Лабораторная диагностика гепатита А (ГА) основывается на определении специфических маркеров инфекций, к которым относятся антиген вируса гепатита А (Аг ВГА), антитела к вирусу гепатита А суммарные (антиВГА lgG+lgM) и класса М (антиВГА lgM).

К методам, используемым в эпиднадзоре за гепатитом А, относятся иммуноферментный (ИФА) и радиоиммунный (РИА) анализы. Наибольшее применение в практике имеет метод ИФА, так как для его постановки не требуется быстроразрушающихся радиоактивных изотопов, реагенты длительно сохраняются и возможна объективная оценка результатов.

2.1. Информативность обнаружения Аг ВГА в эпиднадзоре за ГА

Аг ВГА выделяется с фекалиями инфицированных лиц и больных ГА сравнительно короткий период времени в конце инкубационного периода и, как правило, заканчивается к моменту развития клинических симптомов. Лишь 10-15% больных ГА продолжают выделять Аг ВГА в течение первой недели желтухи. Определение этого маркера позволяет обнаружить труднодиагносцируемые безжелтушные и инаппаратные формы ГА, которые являются источниками инфекции.

Наибольшее эпидемиологическое значение имеет обследование на Аг ВГА лиц, общавшихся с больными ГА в организованных дошкольных учреждениях. При этом в зависимости от интенсивности эпидемического процесса удается обнаружить до 20 % инфицированных.

Обнаружение Аг ВГА у общавшихся является показателем его эпидемиологической опасности для окружающих. Обследование на Аг ВГА необходимо проводить в начале формирования очага, т.е. в первые дни после выявления больного. Вероятность выявления Аг ВГА среди общавшихся повышается при проведении повторных обследований с интервалом в 2-3 недели.

При обнаружении у общавшихся Аг ВГА в фекалиях рекомендуется направить его на консультацию к инфекционисту. При наличии клинических показаний с учетом данных дополнительного лабораторного обследования решается вопрос о госпитализации и соответствующего лечения. При отрицательных результатах дополнительного лабораторного обследования и отсутствии клинических симптомов выявление Аг ВГА у общавшихся из очагов рассматривается как показатель перенесения неаппаратных форм инфекции, которые официально не регистрируются.

Обнаружение Аг ВГА в объектах внешней среды, в частности в воде, подвергавшейся предварительной концентрации, позволяет расшифровать водные вспышки ГА или подъемы заболеваемости на ограниченных территориях, связанных с участием водного фактора передачи. В перспективе возможно использование обнаружения Аг ВГА в пищевых продуктах, не подвергавшихся термической обработке, и смывах с них для аргументации роли пищевого фактора передачи.

2.2. Оценка роли водного фактора передачи ГА

В соответствии с приказом МЗ СССР от 12.07.89 г. N 408 в комплексе санитарно-гигиенических мероприятий, направленных на разрыв фекально-орального механизма передачи инфекции, необходимо предусмотреть лабораторный контроль за объектами окружающей среды с применением санитарно-бактериологических и санитарно-вирусологических методов (определение коли-фагов, энтеровирусов, Аг ВГА). При этом следует иметь в виду, что удовлетворительные санитарно-бактериологические показатели не всегда свидетельствуют об отсутствии вирусной контаминации воды. Используемые в практике косвенные показатели вирусологического загрязнения (например, исследования на энтеровирусы) также не являются безусловными критериями контаминации вирусом ГА. Поэтому определение Аг ВГА в пробах воды имеет самостоятельное значение для оценки роли водного фактора в распространении ГА.

Характерными признаками роли водного фактора распространения инфекции при возникновении подъемов (вспышек) заболеваемости ГА являются:

интенсивный рост заболеваемости на ограниченной территории по сравнению со средними многолетними данными;

возникновение вспышек не только в период сезонного подъема, но и во внесезонный период;

эксплозивный характер вспышек, ограничивающихся преимущественно пределами одного инкубационного периода;

одномоментное вовлечение в эпидемический процесс населения, проживающего на различных территориях, связанных единой системой водоснабжения;

преобладание легких, преимущественно безжелтушных форм заболевания.

6. Высокая пораженность школьников, подростков и особенно взрослого населения.

7. Рост семейной очаговости.

При этом важно иметь в виду, что утверждение об обязательном предшествующем подъему (водной вспышке) ГА росте заболеваемости населения острыми кишечными инфекциями реализуется не постоянно.

При подъеме заболеваемости ГА в случае наличия указанных выше признаков необходимо провести исследование питьевой воды на наличие в ней Аг ВГА. При этом пробы воды отбирают в местах возможного их загрязнения различными стоками. Кроме того, в регионах, неблагополучных по заболеваемости ГА, а также повсеместно в период пред- и сезонного подъема целесообразно исследовать питьевую воду в плановом порядке до и после ее очистки с частотой 1-2 раза в месяц.

2.3. Отбор проб питьевой воды для определения ГА

Отбор проб воды (не менее 30 л) производят в чистые молочные фляги или канистры, бутылки, которые предварительно тщательно моют и обдают кипятком. При проведении работы применяют меры предосторожности против загрязнения отбираемого материала ВГА. В связи с этим работу осуществляют в халате и резиновых перчатках. Из крана концевого участка периферийной водопроводной сети (водозаборных сооружений) без предварительного стекания воды непосредственно или через резиновый шланг заполняют фляги, которые герметично закрывают. Пробы маркируют, указывая место, дату и время забора, и доставляют в лабораторию в максимально короткий срок. Соблюдать условия стерильности при отборе проб нет необходимости в связи с тем, что обнаружение Аг ВГА проводят с помощью ИФА, в основе которого лежит принцип строгой серологической специфичности, и возможная контаминация материала другими вирусами и бактериями не может привести к искажению результата исследования.

2.4. Двухэтапный метод концентрации антигена вируса гепатита А

Процесс концентрации включает два этапа: сорбция-десорбция и осаждение с помощью сульфата аммония. В качестве сорбента используют смесь, состоящую из ионообменной смолы анионита АВ 17-8 и гидроокиси алюминия (ГОСТ 11841-26), которой заполняют специальную колонку. (Возможно использовать бюретку со стекловатой для удержания сорбента). Колонка представляет собой стеклянную трубку длиной 250-300 мм, диаметром 36-38 мм. В нижней части ее впаивают перегородку из стеклянного фильтра Шотта N 2. На резиновую трубку, надетую на нижний конец колонки, устанавливают винтовой зажим. Затем в колонку вносят предварительно приготовленную ионообменную смолу* (высота столбика смолы должна составлять не менее 30-40 мм) и навеску гидроокиси алюминия (5 г).

Исследуемую воду в объеме 30 л и более подкисляют с помощью соляной кислоты до рН 3,0-4,5 и в соответствующей емкости (лучше стеклянная бутыль на 10 л) располагают выше колонки. Вода в колонку попадает самотеком по трубке, соединенной со стеклянным дротом, пропущенным через резиновую пробку (N 36-38). Нижний конец дрота оттягивают таким образом, чтобы капля воды составляла примерно 50 мкл. Затем колонку заполняют водой, подлежащей фильтрации. Собирают систему, добиваясь герметичности при перекрытии верхнего отверстия пробкой, и открывают винтовой зажим. Для удаления пузырьков воздуха из верхней трубки первые порции воды пропускают струйно (1-2 мин), а затем устанавливают скорость, равную 8+-2 мл/мин с помощью винтового зажима.

Вирус (антиген) элюируют 0,05 М глициновым буфером** рН 11,5, который добавляют в объеме 30 мл в колонку после завершения этапа фильтрации и перекрытия винтового зажима. Содержимое тщательно перемешивают и выдерживают в течение 10-15 мин. Затем элюат сливают через систему, открыв винтовой зажим. С помощью глицинового буфера (рН 1,5) в собранном элюате устанавливают рН на уровне 7,0-8,0. Затем проводят антимикробную обработку с помощью хлороформа, который добавляют к элюату в соотношении 1:10. Смесь перемешивают в течение 1-2 мин и центрифугируют при 4 тыс. об/мин в течение 30 мин. Супернатант используют для дальнейшей работы.

Повторное концентрирование (осаждение) вирусов проводят на холоде (при 4°С). К супернатанту дробно (в течение 20-30 мин) добавляют 1/2 объема насыщенного раствора сернокислого аммония***, тщательно перемешивают и оставляют на ночь. Утром смесь центрифугируют в течение 0,5 ч при 4 тыс. об/мин. Супернатант сливают, а осадок растворяют в 1-2 мл физиологического раствора рН 7,2-7,4 и используют для анализа на наличие Аг ВГА с помощью ИФА.

Настоящая методика обеспечивает концентрацию объектов в 10-30 тыс.раз и выше (по объему) в зависимости от количества исходной воды (от 10 до 30 л и более) и позволяет обойтись без сложного дорогостоящего оборудования.

2.5. Обеззараживание оборудования и инструментов

После завершения фильтрации и снятия элюата в колонку с сорбентом вносят 3%-ный раствор хлорамина (хлорцина) или 6%-ный раствор перекиси водорода, выдерживают 30 мин и сливают в емкость с дезраствором. Все элементы системы-колонки, резиновые шланги, пробки, а также флаконы помещают в стерилизатор и подвергают кипячению в течение 60 мин.

Освободившиеся флаги, канистры и бутыли заливают 3%-ным раствором хлорамина (хлорцина) в объеме 2-3 л и выдерживают в течение 30 мин, периодически обмывая внутренние поверхности емкостей. Центрифужные стаканы (пробирки) кипятят или погружают в раствор хлорамина (хлорцина) такой же концентрации и на то же время.

После обеззараживания все элементы системы и принадлежности тщательно моют горячей водой с мылом. Колонку промывают хромпиком, фляги (канистры, бутыли) высушивают на воздухе, а остальные предметы - в сушильном шкафу. Затем флаконы подвергают стерилизации обычным способом.

2.6. Информативность обнаружения антител к вирусу гепатита А класса М (антиВГА JgM)

Заболевание ГА сопровождается активной продукцией ранних специфических антител (антиВГА класса JgM), которые быстро достигают максимальных значений. АнтиВГА JgM присутствуют в сыворотке крови на высоком уровне в инкубационном периоде, с первых дней заболевания и обнаруживаются в дальнейшем в течение 3-6 месяцев.

В связи с этим в клинической практике этот тест используется для специфической лабораторной диагностики ГА, что имеет и эпидемиологическое значение в плане оценки этиологической структуры вирусных гепатитов на конкретной территории. Между тем до недавнего времени этиологическая структура острых вирусных гепатитов устанавливалась практически на основе специфической диагностики гепатита В (ГВ) в результате обнаружения поверхностного антигена HBsАг. При этом имелось в виду, что остальные случаи вирусных гепатитов относятся к ГА. Такой подход к диагностике ГА на современном уровне знаний недостаточен. Это обусловлено отсутствием перекрестного иммунитета между ГА и другими вирусными гепатитами, в частности, ГВ и в связи с этим возможностью развития ГА на фоне длительного носительства HBsАг или хронического ГВ. Не исключаются случаи микст-инфекции, т.е. одновременных заболеваний разными нозологическими формами вирусных гепатитов, например, А и В.

Для этиологической расшифровки вирусных гепатитов, кроме антиВГА JgM, проводится определение специфических маркеров ГВ (HBsАг и антиНВсоч JgM). Это позволяет оценить долю гепатитов А и В, а также гепатита "ни А ни В", включающего гепатиты С и Е.

Тест на антиВГА JgM необходимо также использовать для расшифровки этиологии вспышек ГА, особенно тех, которые возникают в коллективах, где высок процент носительства HBsАг (детские дома, дома ребенка, стационары и др.). Именно в этих условиях расшифровка ГА представляет особый интерес и позволяет дифференцировать проведение противоэпидемических мероприятий в очагах гепатитов А и В, в частности, раздельную госпитализацию больных ГА и ГВ и иммуноглобулинопрофилактику у общавшихся с больными ГА.

С целью выявления источников инфекции в очагах ГА лица, перенесшие заболевания, подозрительные на стертую, безжелтушную форму гепатита с наличием в анамнезе гриппоподобных, диспепсических и прочих симптомов, отмечавшихся в пределах 45 дней до регистрации первого случая ГВ, подлежат обследованию на наличие антиВГА JgM.

Определение антиВГА JgM в очагах среди общавшихся позволяет оценить интенсивность распространения инфекции в конкретном очаге, выявить, является ли зарегистрированный случай, по поводу которого проводится обследование в очаге, первичным либо его возникновение связано с наличием предшествовавших нераспознанных случаев ГА, которые могут рассматриваться как источники инфекции.

Определение антиВГА JgM среди общавшихся в очагах дает возможность определить соотношение между различными формами заболевания, оценить наряду с распространением желтушных труднодиагносцируемых безжелтушных и бессимптомных форм, т.е. выявить истинную распространенность инфекции в очаге.

2.7. Значение определения суммарных антиВГА (антиВГА JgM+JgG)

Определение суммарных антиВГА позволяет оценить состояние иммунитета среди различных популяций населения в зависимости от возраста, географического расположения, факторов риска и пр. Выявлены четкие различия в иммуноструктуре населения разных стран и различных регионов в пределах одной страны. Максимальная заболеваемость регистрируется среди детей, что сочетается с низкой иммунной прослойкой в этой возрастной группе. С возрастом иммунная прослойка нарастает, что определяет практически почти поголовное проэпидемичивание взрослого населения. При достижении в популяции определенного порога невосприимчивых лиц (50%) отмечается снижение уровня заболеваемости.

Регистрируемая заболеваемость ГА и распространенность антиВГА среди населения определенной территории находятся в обратно пропорциональной зависимости и представляют собой два взаимообуславливающих процесса: с одной стороны, величина иммунной прослойки зависит от уровня заболеваемости в предшествующие годы, с другой - уровень заболеваемости определяется величиной иммунной прослойки.

Выборочное наблюдение за уровнем специфического иммунитета к ВГА, особенно в детских возрастных группах, может быть использовано как объективный критерий прогнозирования уровня заболеваемости, а также для коррекции проведения противоэпидемических мероприятий. В возрастных группах, где доля лиц с антиВГА ниже 50%, для профилактики роста заболеваемости необходимо проведение дополнительных профилактических мероприятий, включая иммуноглобулинопрофилактику. Установлено, что более напряженный иммунитет формируется после перенесения желтушных форм в сравнении с безжелтушными и бессимптомными. Это обусловливает возможность возникновения повторных случаев ГА у лиц, перенесших бессимптомную инфекцию.

Определение антиВГА применяется при титровании препаратов иммуноглобулинов с целью выявления высокотитражных серий. В связи с разработкой специфической вакцины против ВГА указанный тест в перспективе может быть использован для оценки эффективности вакцинопрофилактики.

3. Специфические маркеры гепатита В, их эпидемиологическое и диагностическое значение

В составе вириона ГВ имеется три антигена.

1. HBsАг - поверхностный антиген, образующий наружную оболочку.

2. НВеАг - антиген инфекционности - фрагмент внутренней белковой оболочки.

3. НВсАг - ядерный или сердцевинный антиген - геном вируса, покрытый внутренней белковой оболочкой.

К перечисленным антигенам в ходе инфекционного процесса в организме вырабатываются соответствующие антитела: антиНВs, антиНВе, антиНВс. Антигены ГВ и гомологичные к ним антитела признаны ВОЗ специфическими серологическими маркерами ГВ.

НВsАг. Поверхностный антиген свободно циркулирует в крови. Интервал между контактом с вирусом и появлением в крови HBsАг зависит от дозы инфекта и колеблется от 2-3 недель до 3-4 месяцев. Как правило, HBsАг выявляется у больных в стадии инкубации, т.е. до развития биохимических сдвигов в крови, в острой стадии и исчезает в период реконвалесценции. При хронизации процесса ГВ HBsАг продолжает обнаруживаться в течение длительного периода - от нескольких месяцев до нескольких лет. Содержание HBsАг в сыворотке крови при ГВ варьирует в очень широких пределах: от небольших 110 нг/мл, улавливаемых только высокочувствительными методами, до больших величин, порядка 100 мкг/мл. Определение HBsАг является важным диагностическим критерием: обследование на этот маркер позволяет диагностировать до 90% всех форм ГВ, включая субклинические и инаппаратные.

АнтиHBs. При благоприятном течении ГВ, как правило, вскоре после исчезновения HBsАг в сыворотке крови обнаруживаются антиHBs. Возможны случаи, когда интервал между исчезновением HBsАг и появлением антиHBs достигает нескольких месяцев. При этом свидетелями перенесенной инфекции служат НВс класса JgM и суммарные. Защитным действием против повторного инфицирования обладают только анти HBs. Обнаружение антиHBs при отсутствии других маркеров ГВ свидетельствует о развитии иммунитета вследствие вакцинопрофилактики.

НВеАг. Наличие НВеАг в крови свидетельствует об активной репликации вируса в гепатоцитах. НВеАг циркулирует в кровотоке в конце инкубационного периода, в продроме и в начале острого периода. Сыворотки крови, содержащие НВеАг, приблизительно в миллион раз инфекционнее сывороток, содержащих антиНВе. АнтиНВе, как правило, выявляются в период поздней реконвалесценции (до полугода после перенесенного заболевания), реже в более поздние сроки.

Переливание крови от носителя HBsАг, у которого одновременно выявляется НВеАг, более опасно, чем при отсутствии последнего. Установлен высокий риск заражения при соприкосновении с носителями НВеАг в условиях бытового общения. Кроме того, наличие НВеАг у беременной определяет более частую реализацию вертикальной передачи ГВ новорожденным детям.

АнтиНВс. Известно, что НВсАг в сыворотке крови не обнаруживается, а содержится только в ядрах гепатоцитов. Большое значение имеет обнаружение в крови антител к НВсАг, особенно ранних - класса JgM. АнтиНВс JgM появляются же в конце инкубационного периода и циркулируют в течение длительного срока (6-8 месяцев), постепенно сменяясь поздними антиНВс JgG. Наличие антиНВс JgM в высоких титрах (1:1000 и выше) характерно для острой стадии ГВ и раннего периода реконвалесценции, так как их обнаружение коррелирует с продолжающейся репликацией вируса. При хроническом активном гепатите титры антиНВс JgM значительно ниже.

Иногда антиНВс JgM являются единственным диагностическим маркером острого или недавно перенесенного гепатита В в той или иной форме. Обнаружение этого маркера имеет не только диагностическое, но и эпидемиологическое значение, поскольку позволяет выявить источник инфекции при обследовании общавшихся в очагах.

АнтиНВс JgG сохраняются в высоком титре в течение многих лет, а возможно, и пожизненно.

Для решения эпидемиологических задач определяются антиНВс суммарные (антиНВс JgM+JgG). Наличие этого маркера является показателем встречи с вирусом ГВ в прошлом. Кроме того, определение суммарных антиНВс используется для оценки распространенности гепатит В-инфекции в различных группах населения.

В клинической и эпидемиологической практике до настоящего времени в качестве основного маркера используют определение HBsАг.

Приказом N 408 от 12.07.89 г. МЗ СССР "О мерах по снижению заболеваемости вирусными гепатитами" определены контингенты лиц, подлежащих обследованию на HBsАг. К ним относятся доноры, беременные, реципиенты крови и ее компонентов, персонал и пациенты отделений с высоким риском заражения ГВ, больные с хроническими заболеваниями печени, дети домов ребенка, контингенты наркологических и кожно-венерологических диспансеров. Однако определение HBsАг даже с применением высокочувствительных методов (ИФА, РИА) является недостаточным для решения эпидемиологических задач.

Для ГВ характерно преобладание безжелтушных и субклинических форм. Индикация широкого спектра маркеров ГВ с использованием высокочувствительных методов позволяет более достоверно (в 20 и более раз) определить истинную инфицированность больных, госпитализированных в стационары различного профиля, по сравнению с информацией, основанной на выявлении ограниченного числа маркеров с применением малочувствительных методов.

В семейных очагах ГВ среди общавшихся с источником инфекции использование антиНВс суммарных сопровождается приростом выявляемой инфицированности в 2,5-3 раза по сравнению с данными, основанными на определении только HBsАг. Как правило, показателями высокого риска заражения для окружающих является наличие у обследуемого лица независимо от формы заболевания двух маркеров - HBsАг и НВеАг. Особенно важно своевременное определение этих маркеров у беременных женщин в III триместре, потому что риск вертикальной передачи инфекции в указанных случаях может достигать 90%. При эпидемиологических исследованиях, особенно в семейных очагах, определение НВеАг в сочетании с HBsАг позволит обнаружить активный источник инфекции и провести противоэпидемические мероприятия.

Особых сероэпидемиологических подходов требуют семейные очаги ГВ. В приказе N 408 МЗ СССР члены семей лиц с персистирующей антигенемией отнесены к группам риска. Однако лабораторное обследование таких семей на HBsАг предусматривает неполный охват общавшихся и включает лишь доноров, беременных, реципиентов крови, а также лиц, проживающих в очагах больных хроническим ГВ, и носителей HBsАг. В отношении членов семей больных ОВГВ рекомендуется их наблюдение в течение 6 месяцев с момента госпитализации больного. Не уточнен механизм его реализации: кратность, необходимость проведения лабораторного обследования, перечень определяемых маркеров и др.

В связи с этим предлагаются принципиально новые подходы лабораторно-эпидемиологического наблюдения семейных очагов ГВ. Все семейные очаги острого и хронического ГВ должны быть отнесены к группе риска и в полном объеме однократно обследованы на специфические маркеры ГВ: HBsАг, НВеАг, антиНВс суммарные и класса М. Это позволит выявить дополнительные источники инфекции (по нашим данным, в 9,6 раза чаще по сравнению с регламентированным расследованием), обнаружить скрытые формы заболевания ГВ и определить истинную инфицированность. Кроме того, на основе этого серологического обследования общавшихся удается выделить в каждом очаге 3 компонента: эпидемиологически опасных, иммунных и восприимчивых лиц. К группе "активной" инфекции - HBsАг, анти НВс класса JgM, представляющие потенциальную опасность для восприимчивых лиц в очагах. Иммунную группу, не требующую специально последующего наблюдения, составляют носители антиНВс суммарных при отсутствии HBsАг и антиНВс класса JgM. Они не представляют опасности для окружающих. Третья группа лиц - восприимчивые лица, не имеющие специфической защиты против ГВ.

Дальнейшего лабораторно-эпидемиологического наблюдения требуют лишь очаги, в которых наряду с эпидемиологически опасными лицами (источниками инфекции) имеются неинфицированные, т.е. восприимчивые к инфекции. Информативность выявления различных сочетаний специфических маркеров ГВ иллюстрирует табл. 1.

Таблица 1

Информативность обнаружения специфических маркеров ГВ

 
----T------------------------------T-----------------T------------------¬
¦N  ¦ Наименование маркеров        ¦Диагностичес-    ¦ Эпидемиологичес- ¦
¦п/п+---T---T-----T-----T----T-----+кое значение     ¦ кое значение     ¦
¦   ¦HBs¦HBe¦анти-¦анти-¦анти¦анти-¦                 ¦                  ¦
¦   ¦Аг ¦Аг ¦HBe  ¦HBc  ¦HBe ¦HBs  ¦                 ¦                  ¦
¦   ¦   ¦   ¦JgM  ¦сумм.¦    ¦     ¦                 ¦                  ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 1 ¦ + ¦ - ¦  -  ¦  -  ¦  - ¦  -  ¦Редкий вариант   ¦Источник          ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦носительства     ¦инфекции          ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 2 ¦ + ¦ + ¦  -  ¦  -  ¦  - ¦  -  ¦Инкубационный    ¦Источник          ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦период ГВ        ¦инфекции          ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 3 ¦ +-¦ +-¦  +  ¦  +- ¦  - ¦  -  ¦Стадия клиничес- ¦Источник          ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦ких проявлений   ¦инфекции          ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 4 ¦ - ¦ - ¦ +-  ¦  +  ¦ +- ¦  +- ¦Стадия           ¦Источник инфек-   ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦реконвалесценции ¦ции в прошлом     ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 5 ¦ + ¦+- ¦ +-  ¦  +  ¦ -  ¦  -  ¦Хронические      ¦Длительно дейст-  ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦формы ГВ         ¦вующий источник   ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦                 ¦инфекции          ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 6 ¦ - ¦ - ¦  -  ¦  +  ¦ +- ¦ +-  ¦Инфекция в       ¦Источник инфек-   ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦прошлом          ¦ции в прошлом     ¦
+---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+------------------+
¦ 7 ¦ = ¦ - ¦  -  ¦  -  ¦  - ¦  +  ¦Иммунитет после  ¦Показатель эффек- ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦вакцинации       ¦тивности вакцина- ¦
¦   ¦   ¦   ¦     ¦     ¦    ¦     ¦                 ¦ции против ГВ     ¦
L---+---+---+-----+-----+----+-----+-----------------+-------------------
 

4. Специфические маркеры дельта-инфекции и их диагностическая и эпидемиологическая характеристика

В 1977 г. при обследовании HBsАг итальянские исследователи обнаружили в ядрах гепатоцитов дельта-антиген (НД АГ). В дальнейшем было установлено, что это дефектный РНК-вирус размером 36-37 нм, вызывающий острые и хронические заболевания печени, для репликации которого необходим вирус гепатита В, HBsАг которого покрывает РНК дельта-вируса. Вирус гепатита Д термоустойчив, инфекционная активность его не утрачивается при ультрафиолетовом облучении (сохраняется как в цельной крови, так и в ее препаратах.).

Известны два вида дельта-инфекции: коинфекция и суперинфекция, которые различаются по клиническому течению и исходу. Коинфекция характеризуется одновременным заражением вирусом гепатита В и дельта и обычно протекает в более легкой форме, не отличающейся в клиническом отношении от гепатита В. Лишь в отдельных случаях коинфекция может приводить к возникновению тяжелого и даже молниеносного гепатита. Суперинфекция имеет место при инфицировании носителя HBsАг вирусом дельта и часто приводит к более тяжелому заболеванию, чем коинфекция. Диагноз дельта-гепатит возможен только при тщательном серологическом исследовании. В течение первой недели от начала заболевания в сыворотке крови обнаруживается НД антиген, затем последовательно выявляются антитела классов JgM и JgG. Антитела класса JgM обнаруживаются уже в течение первых 10 дней от начала желтухи у 96-100 % больных острым гепатитом дельта. Длительность персистирования анти-дельта класса JgM составляет в среднем от 4 месяцев до 4 лет. При этом следует учитывать, что при остром дельта-гепатите они определяются в высоких титрах, а в случае хронизации заболевания - в низких. В некоторых случаях при дельта-инфекции отмечается угнетение синтеза маркеров ВГВ. При этом HBsАг не определяется высокочувствительным методом. Единственным показателем у таких больных являются анти-дельта класса JgM, а гепатита В - антиНВс класса JgM.

Восприимчивы к дельта-инфекции больных ОВГВ и носители HBsАг. Частота обнаружения анти-дельта среди больных антигенпозитивным гепатитом и циррозами печени достигает 40%. Это свидетельствует о существенной роли дельтаинфекции в этиологии хронических гепатитов и циррозов печени.

Передача инфекции может происходить через кровь и другие секреты человеческого организма, содержащие вирус гепатита дельта. Частые парентеральные вмешательства и длительные контакты в стационарах с носителями вируса ГВ играют существенную роль в распространении и поддержании эпидемического процесса дельта-инфекции.

Регламентированный контроль за этой инфекцией в нашей стране не внедрен. В эпидемиологической практике важно определение двух маркеров дельта-инфекции - анти-дельта суммарных и класса М. Определение анти-дельта суммарных рекомендуется в следующих случаях.

При определении инфицированности вирусом гепатита дельта исследуются на этот маркер сыворотки крови носителей HBsАг и лиц, содержащих другие маркеры ГВ, что позволяет выявить контингенты риска по этой инфекции.

Определение анти-дельта класса JgM рекомендуется в следующих случаях.

1. Для подтверждения диагноза острого гепатита дельта и хронической дельта-инфекции. Этот маркер является наиболее достоверным и чаще определяемым маркером, свидетельствующим об остром течении заболевания.

2. При обследовании носителей HBsАг и антиНВс. Эпидемиология гепатита дельта тесно связана с гепатит В-инфекцией. Поэтому проведение противоэпидемических мероприятий в отношении гепатита В, в том числе в условиях семейных очагов, будет способствовать ограничению распространения дельта-инфекции. Установлена высокая инфицированность вирусом дельта антигенпозитивных больных ГВ, носителей HBsАг и общавшихся с ними, имеющих какие-либо маркеры ГВ. Особого внимания требуют очаги ГВ, в которых выявлен НВеАГ. Это связано с более интенсивным эпидемическим процессом гепатита В и соответственно дельтаинфекции.

Схема использования специфических маркеров вирусных гепатитов А, В, и дельта для решения практических задач приведена в табл.2.

Перечень диагностических тест-систем для определения специфических маркеров вирусных гепатитов и предприятий-изготовителей приведен в приложении.

Таблица 2

Решение практических задач на основе определения специфических маркеров вирусных гепатитов А, В и дельта

 
-------------------------------T----------------------------------------¬
¦               Задача         ¦              Гепатиты                  ¦
¦                              +------------T------------T--------------+
¦                              ¦   А        ¦   В        ¦  Дельта      ¦
+------------------------------+------------+------------+--------------+
¦Определение этиологической    ¦антиВГА JgM ¦антиНВс JgM ¦антиД JgM     ¦
¦структуры вирусных гепатитов  ¦            ¦            ¦              ¦
+------------------------------+------------+------------+--------------+
¦Выявление источников инфекции ¦Аг ВГА,     ¦HBsАг,      ¦антиД JgM     ¦
¦                              ¦антиВГА JgM ¦антиНВс JgM ¦              ¦
+------------------------------+------------+------------+--------------+
¦Определение инфицирован-      ¦антиВГА     ¦HBsАг,      ¦ антиД        ¦
¦ности общавшихся в очагах     ¦            ¦антиНВс     ¦              ¦
+------------------------------+------------+------------+--------------+
¦Изучение иммунного статуса    ¦антиВГА     ¦антиНВs     ¦ антиД        ¦
¦населения                     ¦            ¦            ¦              ¦
+------------------------------+------------+------------+--------------+
¦Контроль иммунного ответа при ¦антиВГА     ¦антиНВs     ¦              ¦
¦проведении вакцинопрофилактики¦            ¦            ¦              ¦
L------------------------------+------------+------------+---------------
 

5. Методы специфической лабораторной диагностики вирусных гепатитов

Для лабораторной диагностики вирусных гепатитов в настоящее время используются иммуноэлектронная микроскопия (ИЭМ), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Разрабатывается метод ДНК и РНК гибридизации.

Наибольшее практическое значение имеют ИФА и РПГА. РИА не уступает по своей чувствительности ИФА, однако его применение затруднено в связи с короткими сроками хранения реагентов (радиоактивные изотопы). РПГА по своей чувствительности уступает ИФА и РИА.

ИФА, как и все методы иммунохимического анализа, основан на взаимодействии между антигеном (Аг) и антителом (Ат). Наибольшее распространение при определении специфических маркеров вирусных гепатитов получил "сандвич" вариант ИФА. Принцип этого варианта ИФА следующий: на поверхности лунок полистироловых планшетов адсорбируются специфические антитела, затем наносится проба, предположительно содержащая Аг. При наличии Аг в ней последний присоединяется к Ат. Образовавшийся комплекс АгАт выявляется с помощью конъюгата, который представляет собой специфические антитела, меченые ферментом. Далее с помощью субстрата (ОФД) выявляют пероксидазу. По интенсивности окраски судят о количестве антигена в анализируемой пробе. Не связавшиеся с твердой фазой ингредиенты в конце каждой фазы удаляются промыванием лунок фосфатно-солевым буферным раствором с детергентом.

При определении специфических маркеров вирусных гепатитов используют различные модификации "сандвич" варианта ИФА, которые описаны в инструкциях к соответствующим тест-системам.

В качестве альтернативного для определения HBsАг может быть использован авторадиографический вариант радиоиммунного анализа на полиэтиленовой пленке.

5.1. Определение HBsАг с помощью авторадиографического варианта радиоиммунного анализа на полиэтиленовой пленке

Радиоиммунологический анализ (РИА), являясь одним из наиболее высокочувствительных методов, широко используется для выявления поверхностного антигена В (HBsАг). В стандартных вариантах РИА в качестве адсорбентов применяются различные синтетические материалы в виде шариков, пробирок, микротитровальных досок с лунками и т.п. В настоящее время HBsАг в иммунорадиометрическом анализе тестируется коммерческим набором, выпускаемым Ташкентским предприятием "Радиопрепарат", в котором твердой фазой служат полиэтиленовые пробирки. Для регистрации результатов при использовании данных наборов необходима специальная радиометрическая аппаратура - гамма-спектрометры, что значительно ограничивает применение данного метода для практики здравоохранения.

В ряде случаев (отсутствие гамма-счетчиков в оснащении лабораторий, полевые условия) более удобен и целесообразен авторадиографический вариант РИА для выявления HBsАг на полиэтиленовой пленке (ПЭП). Этот метод не требует специальной аппаратуры для регистрации результатов, а при использовании в качестве исходного материала для исследования цитратной крови из капилляров Панченкова после определения СОЭ становится удобным при обследовании широких слоев населения для выделения HBsАг. Рентгеновская пленка с автографами дает демонстративную информацию об анализируемых образцах и может служить документом, характеризующим исследуемые сыворотки.

Для установления чувствительности метода РИА на ПЭП с авторадиографической регистрацией результатов полиэтиленовую пленку разрезают на участки, соответствующие нанесенным образцам, и просчитывают радиоактивность на гамма-спектрометре. Радиометрия участков ПЭП, соответствующих образцам, положительным на HBsАг, показала, что их радиоактивность в 2 раза и более превосходит отрицательный контроль, что подтверждает объективность визуальной оценки. Было также показано, что чувствительность метода РИА на ПЭП с авторадиографической регистрацией результатов аналогична таковой стандартного РИА и составляет 5х10(-9) г/мл.

Описание метода. В качестве адсорбирующей поверхности применяется полиэтиленовая пленка толщиной около 0,02 см. Источником ПЭП служат обычные прозрачные хозяйственные пакеты. Наружные поверхности пакетов расчерчивают шариковой ручкой взаимно-перпендикулярными линиями с интервалом 1 см. Пленка помещается расчерченной стороной вниз на ровную пластмассовую или стеклянную пластинку, покрытую влажной фильтровальной бумагой. Реагенты вносят в точки пересечения линий. Сначала в каждую точку пленки наносят до 200 нг препарата гамма-глобулина (антиНВsАг) по 20 мкл. Инкубируют 3 ч во влажной камере при комнатной температуре. Затем раствор антител отсасывают, ПЭП отмывают под струей водопроводной воды и высушивают фильтровальной бумагой. Далее ПЭП погружают на 30 мин в 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина, который затем отмывают. На высушенную пленку помещают анализируемые сыворотки по 20 мкл в точку пересечения линий. Инкубируют 15-18 ч при комнатной температуре, после чего сыворотки отсасывают и пленку промывают. На высушенную пленку наносят J125 антитела к HBsАг с радиоактивностью около 30000 имп/мин в 10 мкл (набор реактивов для иммуннорадиометрического анализа поверхностного антигена ГВ с использованием радионуклида J125. Ташкент). После 3-часовой инкубации при комнатной температуре избыток йодированного препарата отсасывают, а отмытую и высушенную ПЭП помещают на контакт с рентгеновской пленкой на срок до 5 до 18 ч. Результаты учитывают визуально по степени затемнения автографов.

Метод РИА на ПЭП по сравнению со стандартным РИА обладает рядом преимуществ, важнейшим из которых является возможность авторадиографической регистрации результатов, что позволяет применить данный метод в лабораториях, не имеющих специальной аппаратуры. Этот метод прост технически, позволяет использовать малые объемы реагентов и исследуемых сывороток, обладает документальностью и демонстративностью результатов.

Использование в качестве анализируемых образцов для РИА на ПЭП цитратной крови из капилляра Панченкова после постановки СОЭ позволяет рекомендовать данный метод для массовых обследований широких слоев населения с целью выявления носительства.

5.2. Определение HBsАг в реакции иммунорадиометрического анализа с использованием цитратной крови, оставшейся после постановки СОЭ

Применение различных методов индикации маркеров НВ-вирусной инфекции требует, как правило, взятия крови из вены, т.е. дополнительного парентерального вмешательства, что идет вразрез с требованием по их сокращению.

Предлагаемый вариант иммунорадиометрического анализа (ИРМА) с использованием радионуклида J125 исключает необходимость специального взятия крови из вены для выявления HBsАг. Для его осуществления может быть использована цитратная кровь из капилляра Панченкова, оставшаяся после постановки СОЭ.

Описание метода. Цитратную кровь, оставшуюся после проведения СОЭ, из капилляра Панченкова вносят в пробирки РИА наборов и после 14-16-часовой инкубации при температуре 18-25°С проводят выявление антигена согласно инструкции ИРМА HBsАг J125. Ташкент, 1986. Постановка реакции проводится согласно инструкции.

Предложенная модификация метода ИРМА HBsАг J125 отличается от существующего способом получения крови для анализа. Так, известный метод ИРМА HBsАг J125 предполагает взятие крови из вены, что представляет достаточно сложную манипуляцию, чреватую парентеральным заражением. Прилагаемый же вариант, не снижая чувствительности, исключает взятие крови из вены и уменьшает дополнительный риск заражения парентеральными инфекциями. При использовании цитратной крови и для РИА в авторадиографическом варианте открывается возможность широкого обследования населения на HBsАг при проведении общего анализа крови.

Приложение

Перечень
диагностических тест-систем для определения специфических маркеров вирусных гепатитов и предприятий-изготовителей

 
----T-------------------------------T-----------------------------------¬
¦ N ¦     Тест-система              ¦   Место производства              ¦
¦п/п¦                               ¦                                   ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦1  ¦          2                    ¦            3                      ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦1  ¦Иммунодиагностикум для         ¦Н. Новгород, предприятие           ¦
¦   ¦выявления HBsАг эритроцитарный ¦бакпрепаратов                      ¦
¦   ¦иммуноглобулиновый сухой       ¦                                   ¦
¦   ¦(РПГА)                         ¦                                   ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦2  ¦РОПГА                          ¦Иркутск, предприятие бакпрепаратов ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦3  ¦РОПГА                          ¦Ташкент, предприятие ТашНИИ        ¦
¦   ¦                               ¦вакцин и сывороток                 ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦4  ¦РОПГА                          ¦Ташкент, НИИ гематологии и         ¦
¦   ¦                               ¦переливания крови                  ¦
+---+-------------------------------+-----------------------------------+
¦5  ¦РОПГА, жидкий                  ¦Москва, предприятие НИИЭМ          ¦
¦   ¦                               ¦им.Гамалеи                         ¦
L---+-------------------------------+------------------------------------
 

Первый заместитель
председателя Госкомсанэпиднадзора
России
Л.Г.Подунова

 
---------------------------------------------------------

* Методика обработки и подготовки смолы к работе: сухую ионообменную смолу анионит АВ 17-8 замачивают в течение 2-3 ч в дистиллированной воде. Затем воду сливают и смолу, трехкратно обрабатывают смесью из равных объемов свежеприготовленных растворов: 2% HCl и 10% NaCl из расчета 1 мл смеси на 100 г смолы. Общая продолжительность контакта составляет 24 ч. Затем смолу отмывают дистиллированной водой до уровня рН промывных вод 5,5-6,5.

** Глициновый буфер готовят следующим образом: навеску 0,385 г аминоуксусной кислоты растворяют в 100 г воды и получают 0,05 М раствор глицина, из которого готовят растворы N 1 и N 2. Раствор N 1: к 50 мл раствора глицина добавляют 50 мл 0,1 н раствора NaOH - глициновый буфер рН 11,5. Раствор N 2: к 38 мл 0,05 М раствора глицина добавляют 62 мл 0,1 н раствора НCl - глициновый буфер рН 1,5-1,6.

*** Для приготовления насыщенного раствора сульфата аммония в 1 л теплой воды (30-35°С) вносят 800 г (NH4)2S04. Полученный раствор фильтруют, охлаждают в холодильнике и доводят рН до 7,2. Для доведения до нейтральной реакции берут 2 мл раствора сульфата аммония и 40 мл воды и после перемешивания измеряют рН. Затем доводят до необходимого уровня концентрации водородных ионов с помощью раствора аммиака (рН 3,0) и производят расчет необходимого количества аммиака для установления рН 7,2 в насыщенном растворе сульфата аммония.