Методические указания МУ 3.1.1128-02 "Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами" (утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 3 июля 2002 г.)
По состоянию на 25 сентября 2006 года
Методические указания МУ 3.1.1128-02
"Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами"
(утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 3 июля 2002 г.)
Дата введения: 1 октября 2002 г.
1. Область применения
1.1. Методические указания "Эпидемиология, диагностика и профилактика заболеваний людей лептоспирозами" разработаны в помощь специалистам государственной санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических учреждений и противочумных учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с лептоспирозами.
1.2. Методические указания обязательны для выполнения на всей территории Российской Федерации лечебно-профилактическими и санитарно-эпидемиологическими учреждениями, независимо от их подчинения и форм собственности.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ (Принят Государственной Думой Российской Федерации 30 марта 1999 г.).
2.2. Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.
2.3. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24 июля 2000 г.
2.4. Приказ Минздрава СССР от 13.12.79 N 1152 "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом".
2.5. Методические рекомендации "Эпидемиология, диагностика, клиника и профилактика лептоспироза", утвержденные Минздравом РСФСР, 1987.
2.6. Лептоспироз /В кн.: Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных: Сборник санитарных и ветеринарных правил/ Госкомсанэпиднадзор России, Минсельхозпрод России. Москва, 1996. С. 136 - 147.
3. Обоснование
Эпидемическая обстановка по лептоспирозам продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием во всех субъектах Российской Федерации природных и хозяйственных очагов, а также формированием новых стойких очагов инфекции как в сельской местности, так и в городах. В стране ежегодно регистрируется в среднем от 1,5 до 2,5 тыс. заболеваний. На фоне спорадических случаев постоянно регистрируются вспышки в основном "купальные", охватывающие десятки и сотни людей. Зарегистрированы групповые заболевания, связанные с употреблением инфицированной лептоспирами питьевой воды.
В последнее десятилетие широкое распространение получил лептоспироз, вызываемый возбудителями серогруппы Canicola (основной резервуар - собаки); остается высоким удельный вес иктерогеморрагического лептоспироза в общей структуре заболеваемости (основной резервуар - серая крыса). Именно эти этиологические формы обусловливают высокую летальность: в среднем по стране 3 - 4,5%, а на отдельных эндемичных территориях - до 20%.
Реальный уровень заболеваемости лептоспирозами значительно превышает регистрируемые показатели вследствие гиподиагностики, обусловленной низкой клинической выявляемостью больных и недостаточным объемом лабораторных исследований.
За два десятилетия, прошедшие с момента утверждения приказа Минздрава СССР от 13.12.79 N 1152 "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом", произошли существенные изменения в этиологической структуре лептоспирозов, спектре основных хозяев патогенных лептоспир, социальной и возрастной структуре заболевших. Разработаны диагностические препараты нового поколения, в т.ч. простые диагностические тесты, доступные для лабораторий центров госсанэпиднадзора и лечебно-профилактических учреждений любого уровня оснащенности. Внедрена в практику здравоохранения новая слабореактогенная и высокоспецифическая вакцина против лептоспироза.
Настоящие методические указания, отражающие современные принципы и методические подходы к эпидемиологическому надзору, диагностике и профилактике лептоспирозов, были подготовлены в помощь специалистам государственной санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических и противочумных учреждений, осуществляющих организацию и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий по борьбе с лептоспирозами.
4. Эпидемиологический надзор за лептоспирозами
4.1. Общие положения
Эпидемиологический надзор при лептоспирозах основан на: 1) эпизоотологическом мониторинге за эпизоотическим процессом в природных и хозяйственных очагах; 2) слежении за заболеваемостью людей. Эпизоотологический мониторинг в хозяйственных очагах осуществляется специалистами ветеринарной службы, а в природных очагах - службой госсанэпиднадзора. Эта деятельность регламентирована санитарными правилами СП 3.1.091-96 и ветеринарными правилами ВП 13.3.1310-96.
Организационно-методическое руководство работой по профилактике и борьбе с лептоспирозами людей осуществляют отделы особо опасных инфекций или аналогичные структурные подразделения эпидотделов центров государственного санитарно-эпидемиологического надзора в республиках, краях, областях, округах и г.г. Москве и Санкт-Петербурге.
Санитарно-противоэпидемические комиссии органов исполнительной власти участвуют в осуществлении комплекса мероприятий по профилактике заболеваний людей лептоспирозом, по оздоровлению существующих и предотвращению формирования новых очагов лептоспироза.
4.2. Современные особенности эпидемиологии лептоспирозов
По определению ВОЗ (WHO Recommended Surveillance Standards, WHO, 1999), "Лептоспирозы относятся к зоонозам с мировым распространением; наиболее высокий уровень их эпидемического проявления отмечается в странах с влажным субтропическим и тропическим климатом. Заболеваемость характеризуется выраженной сезонностью, часто связана с профессиональной деятельностью и может проявляться в виде вспышек. Дикие и домашние животные многих видов служат источниками возбудителей лептоспир, относящихся к многочисленным сероварам. Инфекция передается человеку посредством прямого контакта с мочой инфицированных животных или через объекты внешней среды, контаминированные мочой животных-лептоспироносителей (главным образом через воду, почву и растения). Тяжесть течения инфекции у человека варьирует от легких до летальных форм. Во многих странах лептоспирозы часто выявляются и регистрируются не полностью из-за сложности клинической диагностики и отсутствия возможности лабораторного подтверждения диагноза. Эпидемиологический надзор создает основу для разработки стратегии вмешательств, осуществляемых службами медицинского и ветеринарного здравоохранения".
В Российской Федерации лептоспирозы относятся к числу широко распространенных зоонозных природно-очаговых инфекций человека, что обусловлено наличием почти на всех территориях природных и хозяйственных очагов, а также формированием новых стойких очагов как в сельской местности, так и в городах.
В стране ежегодно регистрируется в среднем от 1,5 до 2,5 тыс. заболеваний людей. Более половины больных приходится на Северо-Кавказский регион (преимущественно Краснодарский край). Высокий уровень заболеваемости отмечается также в Республиках Адыгее и Мордовии, Калининградской, Тульской, Вологодской, Ульяновской, Пермской областях и др.
Низкие показатели регистрируемой заболеваемости людей или ее отсутствие на территории некоторых субъектов Российской Федерации, особенно при наличии природных и хозяйственных очагов, как правило, свидетельствуют не об истинном благополучии, а о гиподиагностике в результате неудовлетворительной клинической выявляемости больных и недостаточного объема лабораторных исследований.
Лептоспирозная инфекция занимает одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения, частоте летальных исходов и отдаленных клинических последствий. При средних показателях летальности в стране 3 - 4,5% на отдельных территориях, эндемичных по наиболее тяжелым формам, вызываемым лептоспирами серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают, а иногда и превышают, 20%.
Помимо спорадических случаев ежегодно регистрируются эпидемические вспышки, чаще водного "купального" характера, в основном, связанные с нарушениями санитарно-ветеринарных правил при содержании сельскохозяйственных животных частного сектора. Зарегистрированы групповые заболевания, связанные с употреблением инфицированной лептоспирами питьевой воды.
Среди больных преобладают мужчины молодого и среднего возраста. В последнее время отмечается заметная тенденция к урбанизации лептоспирозов. Прогрессирующее возрастание доли городского населения в общей структуре заболеваемости обусловлено ростом типично "городских" этиологических форм лептоспирозов (Icterohaemorrhagiae и Canicola), источником которых являются крысы и собаки, расширением границ городов, освоением территорий природных очагов под лесопарки, садово-огороднические товарищества и другими факторами.
4.3. Резервуары и источники патогенных лептоспир
Более ста видов диких и домашних животных могут быть носителями лептоспир. Основными хозяевами (резервуарами) и источниками возбудителя инфекции среди диких млекопитающих в природе являются грызуны (серые полевки, мыши, крысы и другие виды) и насекомоядные (ежи, землеройки). В хозяйственных (антропургических) очагах эту роль играют домашние животные - собаки, свиньи, крупный рогатый скот, овцы, реже козы и лошади, а также пушные звери клеточного содержания - лисицы, песцы, нутрии.
Непрерывность процесса циркуляции патогенных лептоспир в природе обеспечивается их способностью колонизировать извитые канальцы коркового слоя почек теплокровных хозяев, у которых формируется хроническое, часто пожизненное лептоспироносительство. Возбудители отдельных сероваров также могут персистировать в слизистой оболочке генитального тракта (например, hardjo - у коров, australis - у свиней), тканях центральной нервной системы животных (copenhageni - у серых крыс), глаза (grippotyphosa - периодическая офтальмия и рецидивирующие увеиты у лошадей).
У грызунов и насекомоядных лептоспирозная инфекция протекает бессимптомно, сопровождаясь выделением лептоспир с мочой.
Лептоспирозы у сельскохозяйственных животных и собак протекают остро, подостро или в форме хронического бессимптомного лептоспироносительства. Восприимчивы к лептоспирозам животные всех возрастов, но большей инфекционной чувствительностью обладают молодые особи. Болезнь характеризуется кратковременной лихорадкой, гематурией, иногда желтушным окрашиванием и некрозами слизистых и отдельных участков кожи, а также нарушением функции желудочно-кишечного тракта. У телят чаще, чем у других животных, наблюдается острое течение болезни с высокой летальностью.
У взрослого крупного и мелкого рогатого скота, лошадей и, особенно, свиней, лептоспирозы протекают преимущественно бессимптомно, но заболевание может сопровождаться нарушениями репродуктивной функции: абортами в последнем триместре беременности, рождением слабого или нежизнеспособного потомства и снижением продуктивности. У коров могут развиваться атипичные маститы, у лошадей - периодическая офтальмия и менингоэнцефалиты.
Независимо от течения инфекции и вида животного через 10 - 20 дней у отдельных особей развивается лептоспироносительство длительностью от нескольких недель до 2-х и более лет.
Лептоспирозная инфекция протекает у человека в виде острого заболевания с выраженной интоксикацией, лихорадкой (нередко рецидивирующей), поражением почек, печени, центральной нервной системы, развитием геморрагического синдрома.
Больной человек является "тупиком" для возбудителя инфекции и не имеет практического значения как его источник.
Человек обладает высокой естественной восприимчивостью к лептоспирозам. После перенесенного заболевания остается стойкий серовароспецифический иммунитет.
Патогенным лептоспирам свойственна гостальная (хозяинная) специфичность. Возбудители отдельных сероваров циркулируют преимущественно в популяциях одного или ограниченного круга видов животных, являющихся их основными резервуарами (серовар copenhageni - серая крыса, hardjo - крупный рогатый скот, canicola - собаки, tarassovi, pomona - свиньи и крупный рогатый скот, grippotyphosa - серые полевки, крупный рогатый скот и т.д.). Однако гостальная специфичность носит относительный характер: нередко в эпизоотии вовлекаются и животные других видов, играющие роль дополнительных источников инфекции. Например, лептоспиры серовара copenhageni могут выделяться не только от крыс, но и от свиней, собак, a canicola - помимо собак также от серых крыс, свиней, крупного рогатого скота.
Взаимосвязь лептоспир с животными определенных видов следует учитывать при проведении эпидемиологического обследования. Определение серогруппы (серовара) возбудителя при исследовании выделенных от больных штаммов лептоспир дает возможность эпидемиологу целенаправленно осуществлять поиск источника инфекции.
Наиболее распространенные возбудители лептоспирозов, циркулирующие в природных и хозяйственных очагах на территории Российской Федерации, а также их основные резервуары, представлены в табл. 1.
Таблица 1
Возбудители лептоспирозов и их основные хозяева (резервуары) на территории Российской Федерации
-------------------T------------------------T------------------------T----------------------------¬ ¦ Геномовид ¦ Серогруппа ¦ Серовар ¦ Основные хозяева лептоспир ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Icterohaemorrhagjae ¦Copenhageni ¦Серая, черная крыса ¦ ¦ ¦ ¦icterohaemorrhagiae ¦ ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.borgpeterseni ¦Javanica ¦Poi hanka* ¦Землеройка-бурозубка ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Полевая мышь* ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Canicola ¦Canicola ¦Собака ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.kirschneri ¦Autumnalis ¦erinacei auriti ¦Ушастый еж ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Australis ¦Bratislava ¦Европейский еж ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Pomona ¦Pomona ¦КРС ¦ ¦ ¦ ¦Monjakov ¦Свинья ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦L.kirschneri ¦ ¦Mozdok ¦Полевая мышь ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.kirschneri ¦Grippotyphosa ¦Grippotyphosa ¦Серые полевки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Обский лемминг ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Крупный и мелкий рогатый¦ ¦ ¦ ¦ ¦скот, лошади ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Sejroe ** ¦Saxkoebing ¦Серые полевки ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦L.borgpeterseni ¦ ¦Sejroe ¦Домовая мышь ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦L.interrogans ¦ ¦Hardjo ¦КРС ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.interrogans ¦Bataviae ¦Bataviae ¦Мышь-малютка ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦L.borgpeterseni ¦Tarassovi ¦Tarassovi ¦Свинья, КРС ¦ +------------------+------------------------+------------------------+----------------------------+ ¦* Циркуляция лептоспир серовара hanka среди полевых мышей установлена только в природных очагах¦ ¦Приморского края. ¦ ¦** По старой номенклатуре - серогруппа Hebdomadis. ¦ L--------------------------------------------------------------------------------------------------
4.4. Механизм передачи инфекции
Животные-лептоспироносители выделяют возбудителей во внешнюю среду с мочой, инфицируя воду открытых водоемов, почву, пищевые продукты, корма и другие объекты внешней среды. В организм человека или животного они проникают через повреждения кожных покровов (даже невидимые) и неповрежденные слизистые оболочки полости рта, носа, глаз, желудочно-кишечного и мочеполового трактов. Основной путь передачи инфекции - водный, меньшее значение имеют контактный и пищевой. Заражение человека может происходить через воду пресных естественных и искусственных водоемов (при купании, рыбной ловле, питье воды и т.д.), при употреблении инфицированных лептоспирами пищевых продуктов, а также прямом контакте с больными животными.
Лептоспирозам свойственна летне-осенняя сезонность, однако заболевания, связанные с профессиональным заражением или в домашних очагах (например, от собак), возможны в любое время года.
4.5. Этиологическая структура лептоспирозов
На территории Российской Федерации возбудителями лептоспирозов сельскохозяйственных животных и собак являются лептоспиры серогрупп Pomona, Tarassovi, Grippotyphosa, Sejroe, Icterohaemorrhagiae, Canicola. В природных очагах установлена циркуляция лептоспир серогрупп Grippotyphosa, Pomona, Sejroe, Javanica, Icterohaemorrhagiae, Bataviae, Australis, Autumnalis. В этиологической структуре лептоспирозов человека преобладают возбудители серогрупп Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona и Sejroe.
Согласно последнему решению Международного подкомитета по таксономии лептоспир (1993) серогруппа Hebdomadis разделена на три группы: Hebdomadis, Mini и Seiroe. На территории Российской Федерации доказана циркуляция лептоспир только серогруппы Seiroe (серовары sejroe, saxkoebing и hardjo).
Следует иметь в виду, что в связи с интенсивным развитием международного туризма в последние годы резко возросла вероятность завозных случаев лептоспирозов, вызванных возбудителями "экзотических" сероваров (pyrogenes, djasiman, hebdomadis и др.), циркуляция которых на территории Российской Федерации не установлена.
Этиологическая структура лептоспирозов постоянно меняется в пространстве и во времени. В 80-е годы прошлого столетия на многих территориях Российской Федерации отмечалось возрастание этиологической роли высоковирулентных возбудителей серогруппы Icterohaemorrhagiae (серовары copenhageni и icterohaemorrhagiae; основной резервуар - серая крыса) в общей структуре заболеваемости. Основной причиной этой тенденции явились некоторые формы хозяйственной деятельности человека (развитие рисосеяния, создание рыборазводных прудов и т.д.), приведшей к резкому увеличению численности серой крысы в природных биотопах и урбанизированных ландшафтах и формированию новых стойких очагов иктерогеморрагического лептоспироза.
До 90-х гг. каникулезный лептоспироз (возбудитель - лептоспиры серовара canicola, основной резервуар - собаки) регистрировался среди людей относительно редко, преимущественно при профессиональном заражении работников в питомниках служебного собаководства. В течение последнего десятилетия в Российской Федерации отмечался прогрессирующий рост числа спорадических и групповых случаев этой инфекции, особенно в крупных и средних городах.
К одной из основных причин роста заболеваемости каникулезным лептоспирозом относят резкое увеличение темпов роста численности как бродячих собак, так и животных, содержащихся в домашних условиях. Эпидемиологическая опасность этой формы лептоспирозной инфекции заключается в постоянном тесном контакте человека с источником инфекции - собаками, у которых заболевание нередко протекает в форме бессимптомного почечного лептоспироносительства и долгое время может оставаться нераспознанным. Особую опасность в домашних очагах представляют последствия лептоспирозной инфекции для беременных женщин (особенно при заболевании во 2 - 3-м триместре беременности), которые проявляются в форме самопроизвольных абортов, выкидышей, мертворождений, рождения младенцев с "врожденным" лептоспирозом.
В последние годы носительство лептоспир серогруппы Canicola стало чаще регистрироваться среди сельскохозяйственных животных (свиньи, крупный рогатый скот), что в отдельных случаях приводило к возникновению "купальных" вспышек среди людей.
4.6. Типы очагов
Территории, на которых выявлено носительство лептоспир среди диких животных и заболевания или лептоспироносительство домашних животных, считают очагами лептоспирозов - потенциально опасными для человека. Они подразделяются на природные, хозяйственные (антропургические) и смешанные.
Природные очаги лептоспирозов - это территории, на которых лептоспиры циркулируют в популяциях диких животных. Они имеют ландшафтную стациальную приуроченность и располагаются преимущественно в лесной зоне, по долинам рек, проникая в лесостепную и лесотундровую зоны.
В пределах своего ареала природные очаги встречаются не повсеместно, а в понижениях рельефа, где приурочены, главным образом, к сырым заболоченным биотопам. Обычно они существуют длительное время и могут быть ликвидированы лишь в результате хозяйственной деятельности человека (гидромелиоративные работы и т.п.).
Природные очаги могут быть обнаружены в приозерных котлованах, по осоково-вейниковым болотам, зарослям тростника и рогоза, сырым пойменным лугам, заболоченным травяным участкам, сырым вырубкам и опушкам леса, лесным завалам, валам рисовых чеков, а также на небольших увлажненных участках осушенных территорий.
Основными носителями лептоспир в природных очагах являются различные виды мелких влаголюбивых грызунов и насекомоядных: серые крысы, полевки-экономки, обыкновенные полевки, полевые и домовые мыши, землеройки и др.
Согласно имеющимся данным, в Северном районе Российской Федерации распространены, главным образом, природные очаги лептоспироза grippotyphosa, в Северо-западном, Центральном и Центрально-Черноземном районах - grippotyphosa, saxkoebing, sejroe и poi; Поволжском - grippotyphosa, mozdok, Уральском - grippotyphosa и poi. На Северном Кавказе наибольшая зараженность грызунов отмечена лептоспирами сероваров mozdok.
Наиболее интенсивные природные очаги иктерогеморрагического лептоспироза выявлены в Краснодарском крае (рисовые плантации) и в Калининградской области.
В Западной Сибири, в зонах лесотундры, тайги и лесостепи широко распространены очаги серовара grippotyphosa. Носителями возбудителя, как правило, являются серые полевки, а на северо-западе Сибири - также обские лемминги. В таежной зоне Восточной Сибири имеются природные очаги лептоспирозов grippotyphosa и saxkoebing, резервуаром которых являются полевки-экономки.
На Дальнем Востоке этиологическая структура природных очагов представлена лептоспирами сероваров grippotyphosa, saxkoebing и hanka (серогруппы Javanica). Циркуляция возбудителей серовара hanka в популяциях полевых мышей установлена только на территории Приморского края.
Заражение людей в природных очагах характеризуется приуроченностью к летне-осеннему периоду и происходит во время сельскохозяйственных работ (покоса сырых лугов, при возделывании риса, льна, конопли и других обильно орошаемых культур, уборки сена, урожая на пшеничных, ржаных и овсяных полях, на садово-огородных участках), строительства на вновь осваиваемых территориях, проведения гидромелиоративных работ, охоты, рыбной ловли, туристических походов, неорганизованного отдыха на природе; при несоблюдении мер личной профилактики: употреблении воды из случайных водоемов для питья, умывания, купания или продуктов питания, загрязненных выделениями грызунов.
Механизация большинства сельскохозяйственных работ ограничила возникновение крупных вспышек лептоспирозов в природных очагах. Заболеваемость в них имеет спорадический и групповой характер. Тем не менее, следует считаться с потенциальной эпидемической значимостью природных очагов лептоспирозов при освоении природных ресурсов и особенно при создании на их территориях ирригационных систем, плантаций риса и других обильно орошаемых культур. В этих случаях могут формироваться новые природно-очаговые территории вследствие распространения возбудителя из старых очагов.
Процесс осушения территории, как правило, сопровождается снижением напряженности лоймопотенциала природного очага. Однако повторное избыточное увлажнение, возникающее в результате неправильного использования мелиоративной системы, может вновь привести к его активизации.
В природных очагах также может происходить инфицирование лептоспирами сельскохозяйственных животных.
Хозяйственные очаги не имеют определенной ландшафтной приуроченности и могут возникать повсеместно, как в сельской местности, так и в городах. Их формированию способствует, главным образом, введение в хозяйства (в т.ч. индивидуальные) животных-лептоспироносителей.
Животные-лептоспироносители выделяют лептоспир во внешнюю среду с мочой, инфицируя подстилку, воду, корма, пастбища, почву и другие объекты внешней среды, через которые заражаются здоровые животные.
Пушные звери клеточного содержания заражаются, главным образом, при поедании необеззараженных продуктов убоя от больных лептоспирозами животных и от крыс.
Заболевания у животных в хозяйственных очагах наблюдаются в любое время года, но у животных с пастбищным содержанием - преимущественно в пастбищный период.
Этиологическая структура лептоспирозов в животноводческих хозяйствах, как и в природных очагах, определяется количественным соотношением между различными видами животных. Так, в свиноводческих хозяйствах главная роль в этиологии заболеваний человека принадлежит лептоспирам серовара monjakov (серогруппа Pomona), реже возбудителям серовара tarassovi, а в хозяйствах крупного рогатого скота - сероварам grippotyphosa, pomona, hardjo, реже tarassovi.
В хозяйственных очагах лептоспирозы среди людей регистрируются в виде "купальных" вспышек, а также групповых или единичных заболеваний среди работников животноводческих хозяйств, звероводческих ферм, мясокомбинатов, индивидуальных владельцев скота и других лиц повышенного риска заражения.
"Купальные" вспышки возникают в результате нарушений санитарно-ветеринарных правил при размещении животноводческих ферм и летних лагерей вблизи рек и различных водоемов, водопоя сельскохозяйственных животных из открытых водоемов. Выделения сельскохозяйственных животных-лептоспироносителей попадают в воду, в которой население купается и использует для хозяйственных нужд. При "купальных" вспышках лептоспирозов ярко выражена сезонность (теплое время года). Болеют, как правило, дети и подростки.
В течение всего года регистрируются заболевания среди ветеринарных работников, работников животноводческих хозяйств, звероводческих ферм, зоотехников, собаководов, индивидуальных владельцев скота и др.
Заражение происходит при уходе за животными, ремонте и очистке животноводческих помещений, приеме пищи и курении при несоблюдении правил личной профилактики.
Опасность заражения увеличивается в хозяйствах, находящихся в неудовлетворительном санитарном состоянии, при наличии серых крыс и других грызунов.
Этиология заболеваний людей может отражать этиологию лептоспирозов сельскохозяйственных животных данного очага.
К группам высокого профессионального риска в хозяйственных очагах относятся не только животноводы, но и работники мясокомбинатов и убойных площадок; причем последние заражаются даже чаще, чем лица, ухаживающие за скотом. На мясокомбинатах преимущественно болеют рабочие убойного, субпродуктового, кишечного цехов и санитарной бойни. Заболевания людей на мясокомбинатах регистрируются также на протяжении всего года. При анализе причин неблагополучия в отношении лептоспирозов на мясокомбинатах следует иметь в виду возможность заражения персонала от грызунов, бродячих и сторожевых собак.
В очагах иктерогеморрагического лептоспироза (основной резервуар - серая крыса) болеют лица, по роду своей деятельности соприкасающиеся с синантропными грызунами или загрязненной ими средой (дератизаторы, сантехники, докеры, шахтеры, горнорабочие, рабочие рыборазводных прудов и рисовых плантаций). В последние годы участились случаи заболеваний, вызванных лептоспирами этой серогруппы, у лиц различных профессий, которые заражаются большей частью в природных очагах во время сельскохозяйственных работ, в т.ч. на садово-огородных участках, туристических походов, неорганизованного отдыха на природе, рыбной ловли, охоты и т.п.
Заражение происходит через пищу, воду, другие предметы, загрязненные мочой крыс. Инфекция наблюдается как в городах, так и в сельской местности, в течение всего года с осенним подъемом (в период наибольшей численности крыс) и обычно носит спорадический характер. Лишь при крайне неблагоприятных санитарных условиях (авария на водопроводе, наводнение, загрязнение крысами пищевых продуктов, воды колодцев и т.д.) могут возникнуть вспышки среди населения.
Смешанные очаги характеризуются признаками, свойственными одновременно хозяйственным и природным очагам инфекции. Этиологическая структура заболеваний отражает таковую как у сельскохозяйственных, домашних, так и у диких животных, обитающих в данном очаге.
В городах этиологическая структура очагов лептоспирозов характеризуется преобладанием возбудителей серологических групп Icterohaemorrhagiae и Canicola (основные источники и резервуары, соответственно серая крыса и собаки). В урбанизированных ландшафтах: на территории лесных массивов городов (лесов и лесопарков), вдоль заросших растительностью дренажных канав, берегов прудов (в т.ч. рыборазводных), на суходольных лугах и в других естественных биотопах селитебных зон нередко выявляются стойкие активные природные очаги лептоспирозов. Основными резервуарами инфекции в этих очагах являются серые крысы, полевые мыши, обыкновенные полевки, землеройки-бурозубки и другие виды мелких млекопитающих, соотношение которых и определяет их этиологическую структуру (Grippotyphosa, Pomona и др.).
Кроме указанных типов очагов, возможно внутрилабораторное заражение при работе с грызунами и другими животными, а также непосредственно с культурами вирулентных штаммов лептоспир.
4.7. Мероприятия в эпидемическом очаге
Информация о заболевшем. При появлении заболеваний лептоспирозами среди людей, сельскохозяйственных и других животных устанавливается немедленная взаимоинформация (передача сообщений по телефону, телефаксу и другим современным средствам связи) между медицинскими и ветеринарными работниками для своевременного выяснения эпидемической и эпизоотической ситуации и организации мероприятий по ликвидации и предупреждению распространения инфекции.
О каждом больном и подозрительном на заболевание лептоспирозами медицинским работником направляется экстренное извещение в территориальный центр госсанэпиднадзора (учетная форма N 058). Все случаи лептоспироза учитываются в журнале регистрации инфекционных заболеваний (учетная форма N 060). Следует обязательно указывать, к какой серологической группе относится возбудитель выявленного заболевания.
При выявлении групповых заболеваний с числом заболевших 10 и более республиканские, краевые, областные и окружные центры госсанэпиднадзора немедленно информируют Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России. Подробное донесение представляется не позднее 1 месяца после окончания вспышки.
Все больные с клиническим диагнозом или подозреваемые в заражении лептоспирозом в обязательном порядке должны быть обследованы лабораторными методами в соответствии с действующими рекомендациями.
Разобщение контактных с заболевшими не проводится. Карантин не устанавливается.
Госпитализация больного. Все заболевшие с явными клиническими признаками или подозрительные на заболевание лептоспирозом в обязательном порядке подлежат немедленной госпитализации.
Лечение больных лептоспирозами необходимо проводить только в стационаре. Госпитализация больных в зависимости от тяжести состояния осуществляется в инфекционные отделения или в палаты (отделения) интенсивной терапии.
При дифференциальной диагностике у остро лихорадящих больных и беременных необходимо проводить обследование на лептоспирозы, особенно при наличии эпидпоказаний (наличие в доме собак, грызунов, в личном хозяйстве - сельскохозяйственных животных, пребывание в природных очагах лептоспирозов, риск профессионального заражения и т.п.).
4.8. Эпидемиологическое и эпизоотологическое обследование очага
Эпидемиологическое и эпизоотологическое обследование очага лептоспироза проводит врач-эпидемиолог совместно со специалистом ветеринарной службы в случае появления людей, больных лептоспирозами или подозрительных на это заболевание, а также при выявлении больных животных и лептоспироносителей с целью своевременного принятия мер по предупреждению распространения заболеваний. Если предполагается, что источником заражения людей послужили сельскохозяйственные, промысловые животные, центр госсанэпиднадзора сообщает об этом ветеринарной службе, которая выясняет эпизоотическую ситуацию. По предложению главного государственного санитарного врача района (города) лабораторно обследуются подозреваемые животные, независимо от того, регистрировались ли ранее среди них заболевания.
При проведении эпидемиологического обследования для выявления больных людей проводят обязательное лабораторное обследование всех подозрительных больных и переболевших за последний месяц.
При этом уделяется особое внимание остро лихорадящим больным угрожаемых профессий, а также работающим на увлажненных территориях (луга, рисовые плантации и т.п.), занятых на сельхозработах с применением ручного труда (уборка овощей) на осушенных территориях, где ранее существовали природные очаги лептоспирозов.
Выясняются обстоятельства (за 15 дней, прошедшие от момента первого заболевания), которые могли способствовать инфицированию заболевших: купание, питье некипяченой воды из различных водоемов, хозяйственно-бытовые работы, связанные с употреблением воды, покос и работа на рисовых плантациях, заболоченных участках, ловля рыбы, контакт с сельскохозяйственными животными, собаками, употребление молока от больных коров, разделка туш, наличие грызунов и возможность заражения ими продуктов питания, воды колодцев, водопроводной колонки и т.д. В тех случаях, когда появлению заболевания предшествовало купание или другая форма контакта с водой открытых водоемов, особенно важно установить, где именно произошло заражение (конкретный водоем, участок водоема и т.д.) и как произошло инфицирование водоема (размещение хозяйств, ферм, летних лагерей для сельскохозяйственных животных на берегу водоемов, водопой животных в неустановленных местах, неправильное содержание сельскохозяйственных животных индивидуальными владельцами, обилие грызунов и контакт с ними и т.д.).
Если установлена или подозревается связь заболевания с купанием в открытом водоеме, то необходимо выяснить по медицинской документации, кто из купавшихся в этом водоеме за последние 20 дней обращался за медицинской помощью с температурой 38°C и выше в первые дни болезни и провести обследование этих лиц на лептоспирозы. Если больные выявлены, то необходимо провести подворные обходы для активного выявления лихорадящих больных, не обращавшихся за медицинской помощью, и обследовать их на лептоспирозную инфекцию. Если источником заражения явились собаки индивидуальных владельцев, то обследованию подлежат подозреваемые животные, все члены семьи и другие лица, контактировавшие с собакой.
В случае если предполагается, что инфицирование произошло от грызунов, то в подозреваемых хозяйствах, угодьях, населенных пунктах, природных очагах организуется их отлов и лабораторное обследование. Выясняются возможные связи хозяйственных очагов с природными.
Иногда в одном очаге одновременно регистрируются заболевания людей лептоспирозами, вызванные представителями различных серологических групп. В этих случаях источником инфекции могут оказаться животные различных видов. Эпидемиолог совместно с ветеринарным врачом определяют, каких животных и в каком объеме следует лабораторно обследовать. В некоторых случаях для более полной характеристики очага, в частности, уточнения источника возбудителя инфекции, целесообразно проведение бактериологического обследования и идентификации выделенных культур до уровня серовара.
На основании данных эпидемиологического обследования заполняется "Карта эпизоотолого-эпидемиологического обследования очага зоонозного заболевания" (ф. 391/У).
4.9. Противоэпидемические и противоэпизоотические мероприятия в очаге
Противоэпидемические и противоэпизоотические мероприятия проводятся дифференцированно в очагах разных типов в соответствии с действующими инструктивно-методическими документами (Санитарные правила (СП 3.1.091-96) и ветеринарные правила (ВП 13.3.1310-96). В кн.: Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных).
При возникновении групповых заболеваний людей в случае, если подозревается загрязнение водоема сельскохозяйственными животными, немедленно запрещается купание в нем и использование воды для питья и хозяйственных нужд из этого водоема. Использование воды в последующем разрешается спустя 4 недели с момента устранения причин заражения водоемов. Подозрительная на заражение лептоспирами вода употребляется только после обеззараживания.
В очагах лептоспирозов руководители хозяйств обязаны обеспечить всех работников животноводства спецодеждой и провести инструктаж обслуживающего персонала о мерах личной гигиены и промсанитарии при лептоспирозе. При выявлении лептоспирозов среди животных немедленно принять меры по предупреждению заражения людей, оказанию помощи по выявлению источников инфекции.
Если не установлено возможное место заражения заболевшего лептоспирозом, то при наличии грызунов по месту его жительства проводится дератизация и дезинфекция с использованием любых веществ, предназначенных для дезинфекции помещений и объектов внешней среды, инфицированных непатогенными неспоровыми микробами.
Если известно, что заражение произошло вне дома, эти мероприятия проводятся не в домашнем очаге, а по месту заражения в зависимости от выявленного источника.
В целях предупреждения распространения иктерогеморрагического лептоспироза (основной источник - серая крыса) в наиболее заселенных крысами объектах (животноводческие фермы, жилые застройки, продовольственные склады, шахты, канализационные сооружения и т.д.) проводятся дератизационные мероприятия, принимаются меры по обеспечению грызунонепроницаемости помещений.
В очагах каникулезного лептоспироза совместно с ветеринарными специалистами необходимо проводить работу по выявлению и лечению собак-лептоспироносителей, вакцинопрофилактике и ограничению численности бродячих животных. В соответствии с действующими санитарными правилами обязать индивидуальных владельцев собак вакцинировать своих животных против лептоспироза.
При эпидемических вспышках в целях экстренного оповещения и ознакомления населения с мерами личной профилактики лептоспирозов рекомендуется использовать средства массовой информации (радио, телевидение, печатные издания и т.д.).
4.10. Лептоспирозы как профессиональные заболевания
При регистрации лептоспирозов связь заболевания с профессиональной деятельностью больного устанавливает врач-эпидемиолог территориального центра госсанэпиднадзора, проводящий эпидобследование в очаге заражения. К группам профессионального риска относятся: работники животноводческих хозяйств, мясокомбинатов, боен, утильзаводов, канализационной сети, портов, складских помещений, шахтеры, сельскохозяйственные рабочие, занятые на покосах, жатве, возделывании риса, работники культурных и спортивных учреждений, работающие с животными (цирки, конноспортивные клубы и школы, зоопарки и пр.), персонал лабораторий, работающих с патогенными лептоспирами и различных учреждений и организаций, работающих с мелкими млекопитающими в полевых условиях.
Основным документом, подтверждающим профессиональный характер заражения лептосппрозами, служит карта эпидемиологического обследования (ф. 357/У или ф. 391/У с заполненным вкладным листом).
4.11. Диспансерное наблюдение за переболевшими
Лица, переболевшие лептоспирозом, подлежат диспансерному наблюдению в течение 6 месяцев с обязательным клиническим обследованием окулистом, невропатологом и терапевтом (детей - педиатром) в первый месяц после перенесенного заболевания. В последующие месяцы диспансерные наблюдения осуществляются ежемесячно участковыми врачами с привлечением специалистов по профилю клинических проявлений. Проводятся также контрольные общие анализы крови и мочи, а лицам, перенесшим желтушную форму, - и биохимический анализ крови. Анализы проводят первые два месяца ежемесячно, а в дальнейшем - в зависимости от результатов обследования.
Снятие с учета по истечении срока диспансерного наблюдения проводится при полном клиническом выздоровлении (нормализация лабораторных и клинических показателей). В противном случае сроки наблюдения удлиняются до полного выздоровления.
При наличии стойких остаточных явлений переболевшие передаются под наблюдение специалистам по профилю клинических проявлений (окулистам, невропатологам, нефрологам и др.) не менее чем на 2 года.
Диспансерное наблюдение взрослых возлагается на врачей кабинетов инфекционных заболеваний (при их отсутствии - участковых, цеховых терапевтов), а детей - на участковых педиатров.
5. Профилактика лептоспирозов
5.1. Общие положения
Профилактика лептоспирозов основана на комплексе медико-санитарных и ветеринарно-санитарных мероприятий. Перечень общих профилактических мероприятий, обязательных для учреждений госсанэпиднадзора, ветеринарной службы, предприятий, учреждений, должностных лиц и граждан Российской Федерации определен санитарными правилами (СП 3.1.091-96) и ветеринарными правилами (ВП 13.3.1310-96).
Вопросы профилактики лептоспирозов включаются в региональные программы по вопросам санитарно-эпидемиологического благополучия населения и профилактики особо опасных инфекций. При составлении плана мероприятий учитывается эпидемическая и эпизоотическая ситуация в данной местности, выясняется этиологическая структура заболеваний, наличие природных очагов, численность грызунов, ветеринарно-санитарное состояние животноводческих хозяйств, использование водоемов при размещении летних лагерей для скота, осуществление программы мелиорации и др.
5.2. Профилактика лептоспирозов в зависимости от типов очагов
Мероприятия по профилактике и борьбе с лептоспирозом проводятся дифференцированно в зависимости от типа очага.
Природные очаги. Мероприятия в природных очагах сводятся к их выявлению и оздоровлению. Поиск эпизоотий проводится в местах возможного заражения людей и животных.
При отсутствии заболеваний зараженных зверьков следует искать в сырых заболоченных угодьях, прежде всего в местах, используемых населением для хозяйственных нужд (пастбища, территории, где проводятся гидротехнические и мелиоративные работы, рисосеяние, освоение новых территорий, трассы перегона скота на отгонное пастбище, различные поисковые работы и др.) и отдыха. При обнаружении зараженных зверьков выясняются интенсивность эпизоотии и размеры охваченной ею территории.
После этого разрабатываются конкретные мероприятия по оздоровлению данного очага в зависимости от его эпидемической и эпизоотической значимости. Предусматривается проведение при необходимости гидромелиоративных работ, а также дератизации в жилых помещениях, животноводческих хозяйствах (фермах), зернохранилищах и др. с целью подавления численности и предупреждения миграции зараженных зверьков. Большое значение имеет обеспечение грызунонепроницаемости помещений (жилых, хозяйственных, промышленных), повышающее эффективность противолептоспирозных мероприятий.
Мероприятия по оздоровлению выявленных всех типов очагов лептоспирозов целесообразно включать в комплексный план по борьбе с лептоспирозами или в региональную программу.
Профилактика лептоспирозов в урбанизированных ландшафтах проводится в соответствии с методическими рекомендациями Минздрава России "Критерии и методы оценки потенциальной эпидемической опасности очагов лептоспирозов в урбанизированных ландшафтах и меры профилактики" (Омск, 1997).
Лицам при работе на территории природных очагов лептоспирозов следует соблюдать правила личной профилактики (использовать резиновую обувь, перчатки, следить за тем, чтобы не было порезов рук и ног и т.д.), а постоянно работающим прививаться против лептоспирозов. Осуществляется строгий контроль за хранением и доставкой питьевой воды и пищевых продуктов. Запрещается употребление для питья некипяченой воды из открытых водоемов и купание.
На территории природных очагов лептоспирозов не разрешается выпас и прогон сельскохозяйственных животных, не привитых против этой инфекции.
С целью оздоровления природных очагов иктерогеморрагического лептоспироза проводятся дератизационные работы на эпидемически значимых объектах, в населенных пунктах и открытых стациях ("Инструкция по борьбе с серой крысой в открытых стациях", утвержденная Минздравом СССР 5 июня 1984 г.).
Совместно с заинтересованными ведомствами и учреждениями обеспечивается проведение необходимого комплекса санитарно-технических, санитарно-гигиенических мероприятий по дератизации и снижению численности бродячих собак.
Хозяйственные очаги. В хозяйственных очагах основные усилия сосредоточиваются на оздоровлении животноводческих хозяйств, выявлении и лечении животных-лептоспироносителей, строгом соблюдении ветеринарно-санитарных правил в животноводческих и звероводческих хозяйствах, фермах, питомниках для служебных собак и др., упорядочении водопоя животных и обеззараживании продуктов животноводства, организации регулярной дератизации, а также соблюдении мер личной профилактики при уходе за животными, убое и пр.
Особое внимание уделяется охране водоемов от загрязнения выделениями больных животных и лептоспироносителей. Не разрешается строительство животноводческих помещений и лагерное содержание сельскохозяйственных животных на берегу водоемов без соблюдения соответствующих правил по охране водоемов. Устанавливается строгий санитарный контроль за источниками централизованного водоснабжения, а также за местами купания людей, водопоя скота и спуском сточных вод от животноводческих ферм.
Хозяйство (ферма, отделение, гурт, индивидуальный двор и т.д.), в котором диагностированы лептоспирозы, в установленном порядке объявляется неблагополучным.
План оздоровительных мероприятий разрабатывается главным ветеринарным врачом административной территории, согласовывается с главным врачом центра госсанэпиднадзора и утверждается главой администрации.
В соответствии с действующими инструкциями в хозяйстве вводятся ограничения и устанавливается строгий контроль за их соблюдением.
Молоко, получаемое от больных лептоспирозами животных, нагревается до кипения и употребляется в корм животным.
Грубые корма, в которых обнаружены зараженные лептоспирами грызуны, скармливают только животным, вакцинированным против лептоспирозов.
Вскрытие и снятие шкур с убитых или павших животных проводится с соблюдением мер личной профилактики (перчатки и т.д.).
За работниками хозяйства устанавливается медицинское наблюдение, вплоть до снятия с хозяйства ограничений. Снятие с неблагополучного хозяйства ограничений оформляется актом и проводится под контролем главного ветеринарного врача района, о чем информируется центр госсанэпиднадзора.
Перед снятием ограничений в хозяйстве проводятся механическая очистка и заключительная дезинфекция. Обеззараживанию подвергаются станки (стойла), выгульные площадки и другие места содержания животных, которые могли быть инфицированы мочой лептоспироносителей.
В неблагополучных животноводческих хозяйствах (фермы и др.), в убойных и субпродуктовых цехах мясокомбинатов, на санитарных бойнях персонал должен быть привит против лептоспирозов, работать в специальной одежде: халатах (комбинезонах), резиновых перчатках, сапогах, фартуках и при необходимости пользоваться защитными очками.
По окончании работ спецодежда дезинфицируется 2%-ным раствором хлорамина, руки обеззараживаются этим же препаратом и затем моются с мылом.
Запрещается прием пищи, воды, курение во время работы. Для приема пищи отводится специальное помещение, где должны быть умывальники, 2%-ный раствор хлорамина для обработки рук и закрытые бачки с питьевой водой.
Проводятся дератизационные мероприятия, а также мероприятия по защите от грызунов водоисточников, колодцев, емкостей для хранения воды (баки, цистерны и др.), пищевых продуктов в складских помещениях и в домашних условиях. При работе соблюдаются правила личной профилактики.
В смешанных очагах лептоспирозов мероприятия проводятся по типу как природных, так и хозяйственных очагов, и в зависимости от их интенсивности усиливаются те или иные мероприятия.
В очагах лептоспирозов любого типа и, в первую очередь, в неблагополучных населенных пунктах и хозяйствах, медицинским и ветеринарным работникам, руководителям хозяйств следует постоянно проводить работу по санитарно-гигиеническому образованию в области профилактики лептоспирозов среди населения и групп профессионального риска, в т.ч. через средства массовой информации.
Занятия должны проводиться дифференцированно по специальным программам для каждой из этих групп.
Вопросы личной профилактики лептоспирозов включаются в санитарный минимум или вводный инструктаж для работников мясокомбинатов, животноводческих хозяйств, канализационных сооружений и других групп профессионального риска.
Рекомендуется не реже одного раза в два года проводить семинары по вопросам эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики лептоспироза для врачей лечебно-профилактических учреждений и центров госсанэпиднадзора. Обеспечить регулярную подготовку на рабочих местах бактериологов на базе специализированных лабораторий.
5.3. Специфическая иммунопрофилактика
Иммунизация против лептоспирозов населению проводится по эпидемиологическим показаниям.
Иммунизации подлежат лица, относящиеся к группам профессионального риска заражения (в любое время года), персонал лабораторий, работающих с патогенными лептоспирами, а также лица, направляемые на строительные и сельскохозяйственные работы в места активно действующих природных и хозяйственных очагов лептоспирозов (не позднее, чем за месяц до начала работ). Контингенты риска и время иммунизации определяются территориальными центрами госсанэпиднадзора.
Проведение прививок определяется местными органами здравоохранения в зависимости от эпидемической и эпизоотической ситуации. Для этого анализируется состояние заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных (совместно с ветеринарной службой) за последние годы в каждом населенном пункте.
В выявленных очагах лептоспирозов иммунизируются лица повышенного риска инфицирования: ветеринарные работники, зоотехники, телятницы, свинарки, доярки, собаководы, рабочие, занятые оборудованием или ремонтом стойловых помещений и транспортированием животных, кормов и пр., работники очистных канализационных сооружений, складских помещений, рыбоводческих хозяйств, шахтеры и др. Первостепенное внимание уделяется работникам субпродуктовых и убойных цехов мясокомбинатов, санитарных боен и убойных пунктов. Прививкам также подлежит персонал различных учреждений (в т.ч. ЦГСЭН и противочумных учреждений) и организаций, работающих с мелкими млекопитающими в полевых условиях в природных очагах летоспирозов. Все эти контингенты можно прививать в любое время года.
В эндемичных по лептоспирозам населенных пунктах иммунизируются, главным образом, дети, а также - рисоводы, мелиораторы и другие лица, подвергающиеся риску заражения. В этих случаях прививки проводятся за 2 месяца до эпидсезона.
Прививки проводятся в соответствии с наставлением по применению лептоспирозной вакцины. Иммунизацию целесообразно проводить вакцинами нового поколения с высокими иммуногенными свойствами (например, концентрированной лептоспирозной вакциной производства Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии Минздрава России).
5.4. Экстренная профилактика
В целях экстренной антибиотикопрофилактики лептоспирозов лицам, подвергшимся риску заражения, назначается доксициклин (вибрамицин) по следующей схеме: 1 капсула (0,1 г) один раз в день в течение 5 дней. Решение о проведении экстренной профилактики принимается территориальными центрами госсанэпиднадзора.
При попадании возможно инфицированного материала (при забое животных и т.п.) на кожные покровы немедленно проводится их обработка 5%-ным раствором йода. Слизистые оболочки глаз необходимо промыть 1%-ным раствором борной кислоты, струей воды и ввести в глаза несколько капель 1%-ного раствора азотнокислого серебра; в нос вводят 1%-ный раствор протаргола; рот и горло прополоскать 0,05%-ным раствором марганцово-кислого калия или 1%-ным раствором борной кислоты.
6. Лабораторная диагностика лептоспирозов
6.1. Этиология
Возбудители лептоспирозов людей и животных - спирохеты, относящиеся к виду Leptospira interrogans рода Leptospira, входящего в состав семейства Leptospiraceae порядка Spirochaetales. К роду Leptospira принадлежат также непатогенные лептоспиры-сапрофиты (вид Leptospira biflexa), средой обитания которых является вода естественных или искусственных водоемов и влажная почва. Морфологически патогенные и сапрофитные формы лептоспир неотличимы, поэтому их дифференциация проводится на основе серологических, культурально-биохимических критериев и генетических маркеров.
Типичная лептоспира представляет собой спиралевидное образование, обладающее характерной прямолинейной и ротационной подвижностью. Концы у микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. В культурах некоторых штаммов большинство или все клетки имеют прямые концы (бескрючковые лептоспиры). Длина лептоспиры в среднем составляет 6-20 мюm, а поперечник равен 0,1-0,16 мюm. В зависимости от длины число завитков спирали достигает 20. При продолжительном культивировании in vitro отдельные клетки могут превышать среднюю длину в 2-3 раза. Напротив, в патологическом материале клетки лептоспир значительно короче, чем в культуре.
В жидких средах лептоспиры вращаются вдоль длинной оси и совершают возвратно-поступательные движения без полярной дифференциации. Делящиеся клетки часто энергично и резко изгибаются в точке намечающегося деления. В полужидких средах также наблюдаются изгибание, буравящая и змеевидная подвижность.
Лептоспиры относятся к медленнорастущим аэробным микроорганизмам и культивируются в средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные кислоты с длинной цепью (14 или более атомов углерода). Эти вещества служат основным источником углерода и энергии, а также клеточных липидов. Лептоспиры могут утилизировать неорганические соли аммония (но не аминокислоты) как главный источник азота, а также пуриновые, но не пиримидиновые основания. Для их роста также необходимы тиамин (витамин B1) и цианкобаламин (витамин B12).
Как свежевыделенные, так и музейные штаммы лептоспир, чувствительны к тетрациклину, пенициллину и стрептомицину.
Оптимальный рост лептоспир наблюдается при pH 7,2 - 7,6 (диапазон роста от 6,8 до 7,8), температурный оптимум 28 - 30°C. Период инкубации для достижения оптимального роста обычно составляет 6 - 14 дней, но может варьировать от нескольких дней до 4 недель и более.
Лептоспиры способны проходить через мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,22 мюm, что используется для очистки контаминированных культур от посторонней микрофлоры.
При кипячении лептоспиры погибают моментально, а при нагревании до 56 - 58° - в течение 25 - 30 мин. Они также быстро погибают при высушивании и под воздействием прямого солнечного света. К низким температурам лептоспиры весьма устойчивы и остаются жизнеспособными после длительного замораживания. Растворы 0,1%-ной соляной кислоты, 0,5%-ного фенола инактивируют лептоспир в течение 20 мин, активный хлор в дозе 0,3 - 0,8 мг/л - после двухчасовой экспозиции. Для обеззараживания чистых культур лептоспир рекомендуется использовать 2%-ный раствор соляной кислоты с экспозицией 24 ч, а патологического материала - 5%-ный раствор фенола с экспозицией 2 ч.
Лептоспиры - типичные гидрофилы. Важными условиями для их выживания во внешней среде являются повышенная влажность и pH в пределах 7,0-7,4. В воде открытых водоемов патогенные лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 и более дней, а во влажной почве - до 270 дней. На пищевых продуктах - от нескольких часов до нескольких дней.
Патогенные лептоспиры отличает выраженное внутривидовое разнообразие по антигенным свойствам. Основной таксон - серовар. К настоящему моменту в мире идентифицировано более 230 сероваров патогенных лептоспир, объединенных на основании антигенного родства в 23 серологические группы (табл.3). В соответствии с новой концепцией определения вида у бактерий, на основании результатов ДНК-ДНК гибридизации среди лептоспир выделены семь геномовидов.
Типовой штамм: Leptospira interrogans, серовар icterohaemorrhagiae, штамм RGA.
Сапрофитные лептоспиры характеризуются еще более выраженным антигенным и генетическим разнообразием, чем патогенные. Типовой штамм Leptospira biflexa: серовар patoc, штамм Patoc I.
6.2. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов
Все больные с клиническим диагнозом "лептоспироз" или подозреваемые в заражении этой инфекцией в обязательном порядке должны быть обследованы лабораторными методами в соответствии с действующими рекомендациями. В связи с тем, что клиническая дифференциальная диагностика лептоспирозов представляет значительные трудности из-за полиморфизма клинической картины, результаты лабораторного обследования являются решающими для подтверждения лептоспирозной этиологии заболевания. Кроме того, установление серогруппы лептоспир, вызывавших заболевание, важно для проведения эпидемиологического обследования и целенаправленного поиска источника инфекции.
Современная лабораторная диагностика лептоспирозов основана на комплексе микробиологических и иммунологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.
Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость (СМЖ) больного, а при летальных исходах - паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.
В период лептоспиремии (1-я неделя болезни) для обнаружения лептоспир можно использовать микроскопию цитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК лептоспир в крови методом ПЦР и заражение лабораторных животных.
С конца 1-й, начала 2-й недели в крови больных появляются специфические антитела, которые можно определить с помощью серологических реакций: микроагглютинации лептоспир (РМА), макроагглютинации на стекле (РА), иммуноферментного анализа и других методов.
Начиная со 2-й недели, исследуют ликвор, с 3-й недели - мочу. В случае летальных исходов - паренхиматозные органы на присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопробы).
6.2.1. Метод прямой микроскопии
Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.
Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты "раздавленная капля": небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1,0 - 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.
Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив - Х40, окуляр - X10. Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу или ликвор больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.
Для приготовления цитратной крови смешивают 2 объема крови и один объем 1,5%-ного раствора лимонно-кислого натрия; смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Микроскопируют надосадочную жидкость. Более эффективна подготовка материала способом двойного центрифугирования. На первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 3 000 об./мин в течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную жидкость центрифугируют 30 мин при 10 000 об./мин. Полученный осадок микроскопируют. Метод микроскопии цитратной крови - простой и доступный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако следует помнить, что ввиду его низкой чувствительности (10(6) клеток/мл) и кратковременности периода лептоспиремии (около 1 недели) отрицательные результаты микроскопии цитратной крови не дают основания для исключения диагноза лептоспироз. На фоне антибиотикотерапии диагностическая эффективность микроскопического метода резко снижается. Для подтверждения диагноза и определения серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить серологические и бактериологические исследования. Мочу (средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии или методом центрифугирования.
Микроскопия мочи используется также с целью прижизненного обследования животных (в т.ч. свиней, собак и др.) на лептоспироносительство.
Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и др.) забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Через 2 - 3 мин частицы ткани удаляют, каплю накрывают покровным стеклом и тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой. При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, где локализуются лептоспиры.
Сходным образом готовят препараты для микроскопии из почек грызунов и других животных при их исследовании на лептоспироносительство.
При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:
- наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспир - нитей фибрина, стромы эритроцитов и т.д. От лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;
- наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например, спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;
- дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;
- плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.
Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и тканях используют окраску мазков-отпечатков по Романовскому-Гимза, импрегнацию серебром гистологических срезов по Вартину-Стерри. С этой же целью можно также использовать метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.
6.2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Принцип метода. В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида. Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК, называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента по формуле 2(n), где n - число циклов амплификации.
Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых соответствует определеный температурный режим.
1) Расплетение двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) происходит при 93 - 95°C.
2) Присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре специфической для данной пары праймеров.
3) Синтез новых цепей ДНК протекает при 72°C путем удлинения праймера в направлении 5' - 3'. В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле.
Необходимое оборудование и реактивы
1. Микропипетки полуавтоматические на 1 - 10, 5 - 40, 40 - 200, 200 - 1 000 мкл.
2. Микроцентрифуга на 8 - 12 тыс. об./мин для пробирок, объемом 1,5 и 0,5 мл.
3. Прибор для горизонтального электрофореза.
4. Программируемый термостат (ДНК-амплификатор).
5. Термостат на 45 - 55°C для пробирок, объемом 1,5 мл.
6. Ультрафиолетовый трансиллюминатор.
7. СВЧ-печь или водяная баня на 95 - 100°C.
8. Встряхиватель для микропробирок (типа "Вортекс").
9. Тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans методом ПЦР.
Техника обработки клинического материала и проведения анализа изложены в инструкциях по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.
В качестве исследуемого клинического материала используют кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.
ПЦР-анализ характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (от 10 до 1 000 клеток в пробе) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания (начиная с первых суток), даже на фоне антибиотикотерапии. Поэтому его можно рекомендовать как метод ранней экспресс-диагностики лептоспирозов. При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть отнесена к методам выбора для быстрого лабораторного подтверждения клинического диагноза.
Вместе с тем, отрицательный результат ПЦР-анализа не должен быть основанием для прекращения диагностического поиска, т.к. день начала болезни не всегда точно известен. Диагностическая чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.
6.2.3. Бактериологический метод
Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии. Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза "лептоспироз" и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.
Исследуемый материал от больного - кровь, мочу, СМЖ в количестве 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.
При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,50 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.
Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5%-ной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.
Посевы следует производить в несколько (3 - 5) пробирок или ампул со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 - 30°C.
Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана (Терских, Фервоорта-Вольфа и др.), а также полусинтетические твин-альбуминовые среды.
Среда Терских. Наиболее простой и оптимальной для практического использования является фосфатно-сывороточная среда Терских. Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера (pH = 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды. Основу дважды фильтруют через двуслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120°C в течение 20 мин; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком выбраковывают.
В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH. Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин при температуре 56°C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды). Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56°C в течение 1 ч. После каждого прогревания среда контролируется на стерильность (при 37°C в течение суток).
В основу среды Фервоорта-Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и NaCI (0,5 г на 1 л основы).
Твин-альбуминовая среда.
Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в 100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl - 25 г; ZnSO4 x 7Н2О - 0,4 г; MgCl2 x 6Н2O и CaCl2 x 2Н2О по 1,5 г каждый; FeSO4 x 7Н2O - 0,5 г; пируват натрия - 10,0 г; глицерин - 10,0 г; твин-80 - 10,0 г; тиамин HCl - 0,5 г и цианкобаламин - 0,02 г. Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.
Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы CaCl2 - MgCl2 - 1 мл; FeSO4 - 10 мл; цианкобаламин - 1 мл; твин-80 - 12,5 мл. Доводят РН до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл. Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.
Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный) - 1 г; К2НРО4 (обезвоженный) - 0,3 г и NaCl - 1 г. Затем добавляют следующие растворы; NH4Cl - 1 мл; тиамин - 1 мл; пируват натрия - 1,0 мл и глицерин - 1 мл. pH основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 121°C в течение 20 мин.
Для приготовления жидкой твин-альбуминовой среды 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики.
Селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.
Обработка посуды. При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла. Обработка новой или бывшей в употреблении посуды производится в посудомоечной машине с использованием специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной обработки пробирок состоит из следующих этапов:
- погружение на 24 ч в 1 - 2%-ный раствор соляной кислоты;
- многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;
- обработка ершами в горячем мыльном растворе;
- повторное многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;
- погружение в дистиллированную воду на 24 ч;
- сушка и стерилизация.
Контроль роста культуры. Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят "раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле.
При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 - 10 дней при температуре 28-30°C.
В случае получения хорошего роста (50-100 лептоспир в поле зрения при увеличении х 400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.
Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.
Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые выросшей культурой.
При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно расположенные колонии. На 1%-ной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии.
Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.
Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.
Хранение культур лептоспир. Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах. Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные ампулы (1 - 5 мл) из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев. Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие среды, содержащие 0,2% агара.
При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168°C) или жидкую фазу (-196°C) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10% охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин (от 0 до 130°C).
Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70°C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.
6.2.4. Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных
Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных проводится по результатам биопробы и культурально-биохимическим тестам. Из них наиболее простыми являются выращивание культур при температуре 13°C или в присутствии 8-азагуанина в концентрации 225 мкг/мл. В отличие от патогенных сапрофитные лептоспиры в этих условиях хорошо размножаются.
6.2.5. Метод биопробы
Биологический метод в диагностике лептоспирозов используется редко. Заражение животных подозрительным на наличие лептоспир материалом можно использовать с целью:
- выделения культур лептоспир из контаминированного посторонней микрофлорой материала (ткани органов, моча, вода открытых водоемов, почва и т.д.);
- очистки культур патогенных лептоспир от посторонней микрофлоры;
- определения вирулентности штаммов лептоспир;
- исследования воды открытых водоемов на наличие патогенных лептоспир.
Универсальной лабораторной модели для воспроизведения заболеваний различными сероварами лептоспир не существует.
Оптимальной моделью для воспроизведения иктерогеморрагического лептоспироза служат морские свинки массой 150-200 г, у которых заболевание протекает в первые дни с подъемом температуры до 40-41° и резким падением веса. На 5 - 10-й день после инфицирования высоковирулентным штаммом появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Животные погибают через 12 - 48 ч после появления желтухи при явлении гипотермии. На вскрытии обнаруживается увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани на общем ишемическом фоне ("крылья бабочки").
К лептоспирам других серологических групп морские свинки менее восприимчивы и чувствительны.
Более универсальная модель для воспроизведения экспериментального лептоспироза, вызванного возбудителями различных сероваров, - золотистые хомячки массой 25 - 40 г. Исследуемый материал вводят животным внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые оболочки.
В случае появления клинической картины или гибели животных в острой фазе после аутопсии производят посев из внутренних органов (печени, почек). За животными, не погибшими в первые дни от инфекции, наблюдают в течение месяца. По истечении этого срока их умерщвляют (с учетом требований биоэтики) и производят посевы из коркового слоя почек; из сердца берут кровь (нативную или на фильтровальную бумагу) для исследования на наличие специфических антител с помощью реакции микроагглютинации лептоспир (РМА).
Исследование воды на наличие патогенных лептоспир. Золотистым хомячкам или молодым морским свинкам вводят внутрибрюшинно соответственно 1,0, 10 и 10 мл пробы. Предварительно пробы воды (50,0 мл) можно центрифугировать (в течение 20 мин при 10000 об./мин). Полученным осадком заражают животных (вводят 2-3 мл). Наблюдение за животными и исследование их органов на наличие лептоспир проводят, как описано выше. Ввиду отсутствия лабораторных животных, восприимчивых ко всем эпидемически значимым сероварам лептоспир, а также их низкой концентрации в пробах, выделение возбудителей из воды открытых водоемов удается с трудом и требует больших затрат времени и средств. Отрицательные результаты исследования проб не являются основанием для исключения воды как фактора передачи возбудителя инфекции.
6.2.6. Иммунологические методы
Серологические исследования - основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике "золотым стандартом" остается реакция микроагглютинации лептоспир (РМА), отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидобследования.
С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и др.) с родоспецифическими антигенами лептоспир.
Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20), начиная с 4-го, но чаще на 7 - 8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14 - 17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например, при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2 - 3 месяца от начала болезни.
Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3 - 5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.
В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый - при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй - через 5 - 7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3 - 4 неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-е отр. и 2-е - 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.
У больных с типичной клиникой лептоспироза, характерным эпиданамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования, его следует повторить перед выпиской из стационара, а иногда, особенно при наличии поздних осложнений, в процессе диспансерного наблюдения за реконвалесцентом в течение 3 - 6 месяцев.
При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1 : 100 и выше (соответственно срокам болезни).
Техника постановки РМА при лептоспирозе. Для постановки РМА используют живые культуры лептоспир 6 - 14-дневного возраста плотностью не менее 5 х 10(7) - 10(8) клеток/мл (50 - 100 лептоспир в поле зрения микроскопа при увеличении в х 400), с хорошей подвижностью клеток, без спонтанной агглютинации и посторонних примесей (осадок, контаминация посторонней микрофлорой).
Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Российской Федерации рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир (табл. 2).
Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории России (табл. 3).
Таблица 2
Набор эталонных штаммов лептоспир для РМА, рекомендуемый для диагностических исследований на лептоспироз в Российской Федерации
------T--------------------T----------------------T---------------------¬ ¦ N/N ¦ Серогруппа ¦ Серовар ¦ Эталонный штамм ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 1 ¦Icterohaemorrhagiae ¦ copenhageni ¦ M20 ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 2 ¦ Javanica ¦ Poi ¦ Poi Hanka* ¦ ¦ 3 ¦ ¦ hanka ¦ ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 4 ¦ Canicola ¦ canicola ¦ Hond Utrecht IV ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ (Каширский)** ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 5 ¦ Autumnalis ¦ autumnalis ¦ Akiyami A ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 6 ¦ Australis ¦ australis ¦ Ballico ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 7 ¦ Pomona ¦ Pomona ¦ Pomona ¦ ¦ 8 ¦ ¦ mozdok ¦ П.О.5621 ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 9 ¦ Grippotyphosa ¦ grippotyphosa ¦ Moskva V ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 10 ¦ Sejroe ¦ saxkoebing ¦ Mus24 ¦ ¦ 11 ¦ ¦ wolffi ¦ 3705 ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 12 ¦ Bataviae ¦ djatzi ¦ HS26 ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦ 13 ¦ Tarassovi ¦ tarassovi ¦ Перепелицин ¦ +-----+--------------------+----------------------+---------------------+ ¦* Циркуляция лептоспир серовара hanka установлена только в природных¦ ¦очагах Приморского края, поэтому соответствующий штамм рекомендован для¦ ¦включения в диагностическую панель только на этой территории. ¦ ¦** В скобках указан отечественный аналог. ¦ L------------------------------------------------------------------------
При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, мертиолятом натрия в разведении 1:10 000) или без консерванта. В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. В этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15 - 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения. Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре, и в течение 6 месяцев - в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при 4°C.
Таблица 3
Международный набор референс-штаммов лептоспир для постановки РМА
------T----------------------T---------------------T--------------------¬ ¦ N/N ¦ Серогруппа ¦ Серовар ¦Наименование штамма ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 1 ¦ Australis ¦ Australis ¦ Ballico ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 2 ¦ Autumnalis ¦ Autumnalis ¦ Akiyami A ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 3 ¦ Ballum ¦ Castellonis ¦ Castellon3 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 4 ¦ Bataviae ¦ Bataviae ¦ Van Tienen ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 5 ¦ Canicola ¦ Canicola ¦ Hond Utrecht IV ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 6 ¦ Celledoni ¦ Celledoni ¦ Celledoni ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 7 ¦ Cynopteri ¦ Cynopteri ¦ 3522C ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 8 ¦ Djasiman ¦ Djasiman ¦ Djasiman ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 9 ¦ Grippotyphosa ¦ Grippotyphosa ¦ Moskva V ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 10 ¦ Hebdomadis ¦ Hebdomadis ¦ Hebdomadis ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 11 ¦ Icterohaemorrhagiae ¦ Copenhageni ¦ M20 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 12 ¦ Javanica ¦ Javanica ¦Veldrat Bataviae 46 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 13 ¦ Lousiana ¦ Lousiana ¦ LSU 1945 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 14 ¦ Manhao ¦ Manhao4 ¦ Li130 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 15 ¦ Mini ¦ Mini ¦ Sari ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 16 ¦ Panama ¦ Panama ¦ CZ214 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 17 ¦ Pomona ¦ Pomona ¦ Pomona ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 18 ¦ Pyrogenes ¦ Pyrogenes ¦ Salinem ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 19 ¦ Ranarum ¦ Ranarum ¦ ICF ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 20 ¦ Sarmin ¦ Sarmin ¦ Sarmin ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 21 ¦ Sejroe ¦ Sakkoebing ¦ Mus24 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 22 ¦ ¦ sejroe ¦ M84 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 23 ¦ ¦ wolffi ¦ 3705 ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 24 ¦ Shermani ¦ Shermani ¦ 1342K ¦ +-----+----------------------+---------------------+--------------------+ ¦ 25 ¦ Tarassovi ¦ Tarassovi ¦ Perepelicin ¦ L-----+----------------------+---------------------+---------------------
Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой 1:20 - 1:200), чтобы исключить феномен прозоны. В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.
При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 (с культурой 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.
Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет.
В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах "раздавленная капля" под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении х 200 или х 400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.
При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.
Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.
Агглютинация проявляется в форме склеивании лептоспир и образовании своеобразных конгломератов в виде "паучков", "бантиков", "кос".
Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок трех крестов.
Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии;
+ - примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинированы;
++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;
+ + + - агглютинированы почти все или все лептоспиры.
При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1 - 2 неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.
Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1 600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona. Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippotyphosa.
В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.
Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM, и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.
Реакция макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинации).
Реакцию макроагглютинации (РА) на стекле используют для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя родоспецифические антигены (например, БАСА). Обычно РА используется для предварительного тестирования сыворток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга. Техника постановки реакции проста, поэтому она может быть использована в лабораториях любого уровня оснащенности, в т.ч. и в клинических.
Постановка реакции
1. На чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл слайд-антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей.
2. Спустя 2 - 4 мин в проходящем свете осветителя ОИ-19 или с помощью вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси.
3. Если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.
Контроли
1. Положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию со слайд-антигеном в реакции макроагглютинации при постановке указанным методом.
2. Контроль антигена - слайд-антиген смешивается с физиологическим раствором в указанных выше соотношениях.
Примечание. Испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов. Инактивация сывороток не обязательна.
6.2.7. Идентификация культур
Выделенные на местах штаммы лептоспир идентифицируются до серогруппы с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток.
Идентификацию выделенных штаммов проводят с помощью перекрестной РМА. Для этого необходимо располагать гипериммунными специфическими сыворотками против испытуемого и эталонных штаммов лептоспир. Их перечень соответствует списку диагностических штаммов.
Штаммы относят к одной серогруппе, если титры РМА изучаемого штамма с референс-антисывороткой и референс-штамма с антисывороткой к изучаемому штамму превышают 10%. Серогруппы не имеют официального таксономического статуса. Поэтому следующим этапом идентификации является определение серовара лептоспир (основной таксон).
После выяснения серогрупповой принадлежности штамма исследования проводят в перекрестной РМА, но уже со штаммами, представляющими все серовары серогруппы, к которой выделенный штамм проявил наибольшее сродство.
Эталонные штаммы и антисыворотки к ним, прореагировавшие хотя бы с одной стороны на 10% и более, отбирают для сравнения их с опытным штаммом в перекрестных реакциях абсорбции.
Идентификацию штаммов лептоспир на уровне серогруппы, серовара и субсеровара можно проводить также в РМА с панелями моноклональных антител.
Генетические методы видовой и внутривидовой идентификации лептоспир пока находятся в стадии разработки и не могут быть рекомендованы для практического использования.
В связи с тем, что методы внутривидовой идентификации лептоспир достаточно сложны и трудоемки, выделенные от людей животных или объектов внешней среды изоляты следует направлять для идентификации в Сотрудничающий Центр ВОЗ и Минздрава России по лептоспирозам (на базе лаборатории лептоспирозов ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН).
Главный государственный
санитарный врач Российской Федерации -
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.Онищенко
