Письмо Минздрава РСФСР от 12 октября 1989 г. N 21-08/11-297 "О повышении качества люминесцентно-микроскопических исследований материала для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ)"
По состоянию на 25 сентября 2006 года
Практическими и научно-исследовательскими учреждениями приобретен достаточно большой положительный опыт по совершенствованию люминесцентной микроскопии для диагностики бактериовыделения у больных туберкулезом, позволяющий повысить результативность указанного анализа, сократить затраты рабочего времени в отдельных моментах исследования и обезопасить персонал при работе с вирулентной культурой.
Руководителем микробиологической лаборатории НПО "Фтизиопульмонология" д-р. мед. наук В.М.Должанским, зав. лабораторией Московского противотуберкулезного диспансера N 4 Н.Ф.Жаком и врачом Е.М.Морель на основании анализа опыта применения люминесцентной микроскопии в противотуберкулезных учреждениях подготовлены предложения по совершенствованию существующего метода.
В зависимости от возможностей лабораторий окраска мазка производится по Хагеманну или по Бою. Последний метод нашел меньшее число последователей из-за дефицитности и высокой стоимости одного из основных красителей (родамина), поэтому в настоящем письме акцент сделан на окраску по Хагеманну, но учтены и особенности окраски по Бою.
Окраска по Бою сложнее окраски по Хагеманну и много дороже. Ее внедрение во многих лабораториях определяется большим объемом информации, получаемой микроскопистом при использовании данной методики: снижается риск выдачи положительного ответа при обнаружении сапрофитной флоры, появляется возможность дифференцировать возраст микобактериальных клеток и т.д. Однако тонкая дифференцировка, достигаемая при окраске по Бою, требует и дополнительных затрат времени. Так, при изготовлении мазка из осадка материала, подготовленного для посева, необходимо прямо на предметном стекле проверить рН суспензии и добиться его значения в 6,5-7,0 единиц (проверяется мелкими лакмусовыми бумажками). Для подшелачивания используют 0,5% раствор NaOH, для подкисления - 0,5% раствор НСl. Для окраски по Хагеманну эта процедура необязательна.
При всех видах окраски абсолютно необходима плотная фиксация мазка на стекле. Жидкий материал (мочу, экскрет после ингаляций, ликвор и т.д.) обязательно наносят на предметные стекла, предварительно смазанные взбитым яичным белком. В условиях холодильника такие стекла хранятся неограничено долго и могут заготавливаться впрок.
Не следует спешить с термальной фиксацией мазка. Вначале мазок подсушивают на воздухе - на нем не должно оставаться мелких капель - затем фиксируют в сухожаровом шкафу при 90°С в течение 30 минут. Отсчет времени начинают с момента достижения температуры 90°. При этом происходит не только хорошая фиксация материала, но и дальнейшая работа с мазком становится безопасной.
Оригинальный метод окраски разработан в Московском противотуберкулезном диспансере N 4. В настоящее время этим простым и надежным методом пользуются практически все лаборатории Москвы.
Реактивы: 1) 10% раствор Na_3PO_4
2) 5% раствор карболовой кислоты
3) 0,1% раствор аурамина
Для лучшего растворения аурамин в течение суток выдерживается в термостате. Перед употреблением растворы аурамина и карболовой кислоты профильтровываются через обеззоленный бумажный фильтр. Эти растворы готовят из расчета недельной потребности.
4) 3% солянокислый спирт
5) Раствор кислого фуксина: 390 мл дистиллированной воды, 1 грамм кислого фуксина и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Перед употреблением кислый фуксин профильтровать через обеззоленный бумажный фильтр. Растворы солянокислого спирта и кислого фуксина можно готовить впрок.
Отличием от рутинного метода Хагеманна нужно считать 2 основных момента:
а) раствор аурамина готовят без добавления карболовой кислоты и б) мазок перед окраской заливают раствором карболовой кислоты, что выравнивает рН всей поверхности мазка, улучшает и ускоряет проникновение краски в клетку возбудителя, а это способствует хорошему свечению клеток по всей просматриваемой площади.
Ход работы (экономный вариант). Материал обрабатывается 10% раствором Na_3PO_4 18-24 часа в термостате.
На следующий день из плевательниц осторожно сливают верхний слой жидкости, горлышко плевательницы фламбируют на пламени горелки, осторожно перемешивают содержимое плевательницы и разливают по центрифужным пробиркам. Горлышко центрифужные фламбируют на пламени горелки. Если материал идет на посев и бактериоскопию, содержимое плевательницы разливают в две центрифужки.
Приготовление мазков
Центрифугирование - 2000 об/мин. 15 минут. Надосадочную жидкость полностью сливают. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени горелки.
Осадок энергично взбалтывают и 1-2 капли через край наносят на предметное стекло. Горлышко центрифужки фламбируют на пламени. Донышком центрифужки на предметном стекле делают не толстый круглый или овальный мазок.
Окраска: а) мазки раскладывают на рельсы и заливают 5% р-ром карболовой кислоты на 2 минуты. Через 2 минуты р-р карболовой кислоты с мазков сливают, торец стекла высушить фильтровальной бумагой;
б) без промывки мазков на них наносят 0,1 р-р аурамина на 2 минуты;
в) мазки промывают с тыльной стороны проточной водой;
г) обесцвечивание 3% солянокислым спиртом дважды по 2 минуты;
д) промывка с тыльной стороны струйкой воды;
е) мазки заливают р-ром кислого фуксина на 2 минуты;
ж) промывка стекол с мазками с тыльной стороны. Сушка на воздухе.
Микроскопия
Аналогично можно готовить мазки для окраски по Цилю-Нильсену взамен исследования флотационного кольца, но при этом исключается обработка мазков карболовой кислотой.
Метод информативен, прост, позволяет экономить лабораторную посуду, повысить производительность труда, рекомендуется к повсеместному внедрению.
