Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 28 января 1980 г. N 2142-80)
По состоянию на 25 сентября 2006 года
Методические указания по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях хроматографией в тонком слое
(утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 28 января 1980 г. N 2142-80)
Настоящие Методические указания распространяются на определение содержания ДДТ, ДДЭ, ДДД, гексохлорана, алдрина, кельтана, гептахлора, метоксихлора, дактала, тедиона и эфирсульфоната в воде, почве, вине, овощах, фруктах, грибах, зерне, комбикормах, корнеклубнеплодах и зеленых кормах, рыбе, мясе, мясопродуктах, внутренних органах, молоке и молочных продуктах, животном жире, сливочном и растительных маслах, жмыхах, шпротах, лузге, меде, сахаре, яйцах и яйцепродуктах, а также в табачных изделиях.
I. Характеристика анализируемых пестицидов
Краткая характеристика препаратов представлена в табл. 1.
2.1. Принцип метода.
Метод основан на хроматографии хлорсодержащих пестицидов в тонком слое окиси алюминия, силикагеля или пластинок "Силуфол" в различных системах подвижных растворителей после экстракции их из исследуемых образцов и очистке экстрактов. Подвижным растворителем служит н-гексан или н-гексан в смеси с ацетоном.
Таблица 1
Физико-химические свойства пестицидов
------T---------------T---------------T--------------T---------T------------------T-------------------------¬ ¦ N ¦ Пестицид ¦ Химическое ¦ Эмпирическая ¦ Мол. ¦ Темп.°С ¦ Растворимость ¦ ¦ пп ¦ ¦ название ¦ формула ¦ масса ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +----------T-------+---------T---------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦плавления ¦ кип ¦ в воде ¦в орг. растворе¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ мм: ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦рт.ст. ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 1. ¦Альдрин ¦1, 2, 3, 4, 10,¦ С12Н8CI6 ¦ 364,92 ¦104 - 105 ¦ ¦ н ¦гексан, бензол,¦ ¦ ¦ ¦10-гексахлор-1,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ацетон, спирты ¦ ¦ ¦ ¦4-эндо-5, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ и др. ¦ ¦ ¦ ¦8-экзо-димети- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦лен-1, 4, 4а,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦5, 8,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦8а-гексагидро- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нафталин ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 2. ¦Гексахлоран ¦1, 2, 3, 4, 5,¦ С6Н6Сl6 ¦ 290,82 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦6-гексахлорцик-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦логексан ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 3. ¦Гексахлорбензол¦1, 2, 3, 4, 5,¦ С6Сl6 ¦ 264,8 ¦ 231 ¦ 322 ¦ тр-р ¦бензол, спирты,¦ ¦ ¦ ¦6-гексахлорбен-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦четыреххлорист.¦ ¦ ¦ ¦зол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ углерод, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ керосин, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ бензол. ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 4. ¦Гептахлор ¦1, 4, 5, 6, 7,¦ С10Р5CI7 ¦ 373,5 ¦ 95 - 96 ¦ 117 - ¦ н ¦ циклогексан, ¦ ¦ ¦ ¦8-гептахлор-4, ¦ ¦ ¦ ¦ 196 ¦ ¦ ксилол, ¦ ¦ ¦ ¦7-эндо-метилен-¦ ¦ ¦ ¦(0,05) ¦ ¦ четыреххлор. ¦ ¦ ¦ ¦3а, 4, 7,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ углерод, ¦ ¦ ¦ ¦7а-тетрагидрои-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦керосин, бензол¦ ¦ ¦ ¦нден ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 5. ¦п.п' ДДД ¦4, 4' -¦ С14Н10CI4 ¦ 320,0 ¦ 112 ¦ ¦ н ¦ацетон, бензол,¦ ¦ ¦ ¦дихлордифенилх-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ гексан и др. ¦ ¦ ¦ ¦лорметилметан ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 6. ¦п.п' ДДТ ¦4, 4' -¦ С14Н9CI5 ¦ 354,5 ¦ 108,5 - ¦185 (1)¦ 0,001 ¦ацетон, бензол,¦ ¦ ¦ ¦дихлордифенилт-¦ ¦ ¦ 109 ¦ ¦ ¦гексан, спирты ¦ ¦ ¦ ¦рихлорметилме- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ и др. ¦ ¦ ¦ ¦тан ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 7. ¦п.п' ДДЭ ¦4, ¦ С14Н9CI4 ¦ 318,0 ¦ ¦ ¦ 0,014 ¦ацетон, гексан,¦ ¦ ¦ ¦4-дихлордифени-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ бензол ¦ ¦ ¦ ¦лдихлорэтилен- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 8. ¦Дактал ¦Диметилтетрах- ¦ C10H6О4CI4 ¦ 332,0 ¦ 156 ¦ ¦ ¦ацетон, гексан,¦ ¦ ¦ ¦лортерефталат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ бензол, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ хлороформ. ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 9. ¦Кельтан ¦4, 4' -¦ С14Н9ОCI5 ¦ 370,4 ¦78,5 - 79 ¦ 225 ¦ н ¦ Толуол, ¦ ¦ ¦(Хлорэтанол) ¦дихлордифенилт-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ хлороформ, ¦ ¦ ¦Кетан ¦рихлорметилкар-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ серный эфир, ¦ ¦ ¦ ¦бинол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦гексан, бензол,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ спирты ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 10. ¦Метоксихлор ¦4, 4' -¦ C16H15O2CI3 ¦ 345,65 ¦ 70 - 85 ¦ ¦ тр-р ¦ ацетон, ¦ ¦ ¦ ¦диметоксидифе- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦четыреххлор,ис-¦ ¦ ¦ ¦нилтрихлорметил¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ тый углерод, ¦ ¦ ¦ ¦метан ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ хлороформ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ бензол и др. ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 11. ¦Тедион ¦4-Хлорфенил -¦ C12H6O2CI4S ¦ 356,07 ¦ 146-147 ¦ ¦0,02 (56)¦бензол, ксилол,¦ ¦ ¦ ¦2, 4,¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ толуол, ¦ ¦ ¦ ¦5-трихлорфенил-¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ хлороформ ¦ ¦ ¦ ¦сульфон ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+---------------+ ¦ 12. ¦Эфирсульфонат ¦4-хлорфенил -¦ C12H8CI2SO3 ¦ 303,06 ¦ 86,5 ¦ ¦ н ¦ ацетон, ¦ ¦ ¦ ¦4-хлорбензол ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ дихлорэтан, ¦ ¦ ¦ ¦сульфонат ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ксилол, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ циклогексан, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦четыреххлорис- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ тый углерод ¦ L-----+---------------+---------------+--------------+---------+----------+-------+---------+----------------
Места локализации препаратов обнаруживают после опрыскивания пластинок раствором аммиаката серебра с последующим ультрафиолетовым облучением или после облучения ультрафиолетовым светом пластинок "Силуфол", содержащих о-толидин.
2.2. Метрологическая характеристика метода.
Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 2.
2.3. Реактивы и растворы
Ацетон хч, ГОСТ 2603-71
Аммиак водный хч, ГОСТ 3760-64
Алюминия окись 2 ст. активности для хроматографии, ч, МРТУ 6-09-5296-68. Просеивают через сито 100 меш.
Алюминия окись, пропитанная серной кислотой. Две весовые части окиси алюминия (или окиси кремния) помещают в фарфоровую ступку, заливают одной объемной частью серной кислоты и тщательно перемешивают. Смесь готовят непосредственно перед подготовкой колонок для очистки экстрактов из проб шротов, жмыха, лузги.
Бензол хч, ГОСТ 5955-68.
Н-гексан ч, МРТУ 6-09-2937-66
Калий щавелевокислый чда, ГОСТ 5868-68
Кальций сернокислый чда, ГОСТ 3210-66. Просушивают 6 часов в сушильном шкафу при 160°С. Просеивают через сито 100 меш.
Кремния окись для люминофоров ч, МРТУ 6-09-4875-67
Натрий сернокислый безводный ч, ГОСТ 4166-66
Натрий углекислый кислый хч, ГОСТ 4201-66, 0,5 н. раствор
Натрий хлористый хч. ГОСТ 4233-66, насыщенный раствор
Петролейный эфир (темп. кип. 40 - 70°)
Перекись водорода хч, (30% водный раствор) ГОСТ 10929-64
Проявляющие реактивы:
Проявляющий реактив N 1. 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, прибавляют 7 мл аммиака и доводят объем раствора до 100 мл ацетоном: в готовый раствор можно добавить 0,2 мл перекиси водорода. Раствор следует хранить в колбе с притертой пробкой в темном месте в течение 3-х дней. На пластинку 9 х 12 см расходуется 8 - 10 мл раствора.
Таблица 2
Метрологическая характеристика метода определения хлорорганических пестицидов
Диапазон определяемых концентраций 0,005 - 2,0 мг/кг или мг/л
-----------------------T-----------T----------T----------T-----------T----------T----------T-----------
Анализируемая проба ¦ Предел ¦ Число ¦ Размах ¦ Среднее ¦Стандарт- ¦Относите- ¦Доверите-
¦обнаружения¦параллель-¦варьирова-¦ значение ¦ ное ¦ льное ¦ льный
¦ мг/л или ¦ ных ¦ ния, % ¦определения¦отклонение¦стандарт- ¦ интервал
¦ мг/кг ¦определе- ¦ ¦ % ¦ % ¦ ное ¦
¦ ¦ ний ¦ ¦ ¦ ¦отклонение¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ % ¦
-----------------------+-----------+----------+----------+-----------+----------+----------+-----------
Вода 0,005 7 20 93 10 10,7 7,7
Вино 0,005 7 25 90 12 13,3 9,0
Овощи 0,05 7 20 83 12 14,4 9,0
Фрукты 0,05 6 20 81 9 11,1 7,4
Зерно 0,05 7 25 75 10 13,3 7,5
Трава 0,025 10 30 74 12 16,2 7,6
Рыба 0,05 10 24 83 12 14,4 7,6
Мясо 0,05 10 30 87 15 17,2 9,5
Животный жир 0,04 6 26 82 12 14,6 9,9
Молоко, сливки, творог 0,04 13 30 86 16 18,6 8,9
Сливочное масло 0,05 8 30 83 17 20,0 12,0
Сахар 0,02 6 6 97 5 5,1 4,1
Почва 0,06 70 9 7,9
Проявляющий реактив N 2., 0,5 г азотнокислого серебра растворяют в 5 мл дистиллированной воды, добавляют 10 мл 2-феноксиэтанола и доводят объем раствора до 200 мл ацетоном, затем добавляют 6 капель 30%-ной перекиси водорода.
Серебро азотнокислое чда, ГОСТ 1277-63
Серная кислота ч, ГОСТ 4204-66
Силикагель АСК (Воскресенского химкомбината Московской обл.)
Силикагель КCK, просеянный через сито 100 меш.
Стандартные образцы:
ДДТ, ДДД, ДДЭ, алдрин, изомеры ГХЦГ, гептахлор, метоксихлор, кельтан, эфирсульфонат, дактал, тедион хч.
Стандартные растворы: 10 мг соответствующего пестицида растворяют в мерной колбе на 100 мл в н-гексане и доводят до метки этим растворителем. Стандартные растворы необходимо хранить в стеклянной посуде с притертыми пробками в холодильнике.
Стеклянная вата, очищенная конц. серной кислотой, промытая дистиллированной водой и высушенная.
о-Толидин ч, МРТУ 6-09-6337-69, 1% paствор в ацетоне.
2-фенокспэтанол
Этиловый спирт, ректификат - ТУ 19-II-39-69
Хлороформ хч, ГОСТ 200-15-74
Четыреххлористый углерод хч, ГОСТ 20228-74
Этиловый эфир (для наркоза) Фармокопея СССР
Натрий сернокислый, 2% водный раствор
Натрий сернокислый, насыщенный раствор
2.4. Приборы и посуда
Баня водяная, ТУ 64-I-2850-76
Вакуумно-ротационный испаритель, ИР ТУ 25-II-310-69 или прибор для отгонки растворителей, МРТУ 22-II-67-67
Воронки химические, диам. 6 см, ГОСТ 86-13-64
Воронки делительные, емкостью 100, 250, 500 мл, ГОСТ 10054-75
Воронки Бюмнера, ГОСТ 9147-69
Гомогенизатор или измельчитель тканей
Камера для опрыскивания, ТУ 25-II-430-70
Камера для хроматографирования, размером 150 х 200, 105 х 165 мм ГОСТ 10565-63
Колбы Бунзена, ТУ 25-II-135-69
Колбы мерные, емкостью 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74
Колбы нш, емкость 100, 250, 500 мл, ГОСТ 10394-63
Колбы круглодонные нш, емкостью 150, 250, 500 мл, ГОСТ 10394-63
Микропипетки, ГОСТ 1770-74 (для нанесения стандартных растворов)
Пипетки или шприцы для нанесения проб
Пипетки емкостью 1, 5, 10 мл, ГОСТ 1770-74
Прибор для встряхивания, МРТУ 2451-64
Пластинки стеклянные 9 х 12, 13 х 18 см
Пульверизаторы стеклянные для опрыскивания пластинок
Сито на 100 меш (диаметр отверстий 0,147 мм)
Стеклянные хроматографические колонки, (диаметр-высота) 20 х 400, 15 х 150
Ртутно-кварцевая лампа
Цилиндры мерные емкостью 25, 50, 100, 250, 500 мл, ГОСТ 1770-74
Чашки выпарительные N 3, N 1, ГОСТ 9147-69
Приготовление пластинок для хроматографии
Тщательно промытую хромовой смесью, раствором соды, дистиллированной водой и высушенную пластинку протирают этиловым спиртом или эфиром и покрывают сорбционной массой. Массу готовят следующим образом:
а) 50 г просеянной через сито 100 меш окиси алюминия смешивают в фарфоровой ступке с 5 г сернокислого кальция, прибавляют 75 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до образования однородной массы. На пластинку 9 х 12 см наносят 10 г сорбционной массы (на пластинку 13 х 18 см - 20 г) и, покачивая, равномерно распределяют по всей пластинке. Пластинки сушат при комнатной температуре 18 - 20 часов, можно сушить их 20 минут при комнатной температуре, а затем 45 минут в сушильном шкафу при температуре 110°С.
б) 35 г силикагеля КСК, просеянного через сито 100 меш, смешивают с 2 г сернокислого кальция и 90 мл дистиллированной воды и перемешивают в ступке или колбе до однородной массы. Наносят на пластинки и сушат как указано выше. Порция расчитана на 10 пластинок.
Если пластинки с тонким слоем силикагеля темнеют после облучения УФ-светом, силикагель перед употреблением следует очистить от примесей. Для этого силикагель заливают на 18 - 20 часов разбавленной соляной кислотой (1:1), кислоту сливают, промывают силикагель водой и кипятят в круглодонной колбе 2 - 3 часа с разбавленной азотной кислотой (1:1), промывают проточной водопроводной, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод, сушат в сушильном шкафу 4 - 6 часов при температуре 130°. Силикагель дробят и просеивают через сито 100 меш.
Пластинки для хроматографии "Силуфол" UV-254 производства ЧССР перед использованием импрегнируют о-толидином. Для этого каждую пластинку опускают на 0,5 см в 0,1% раствор о-толидина в ацетоне, налитый в камеру для хроматографирования. После того, как фронт растворителя поднимется до верхнего края пластинки, ее вынимают и высушивают на воздухе, избегая прямого солнечного света. После этого пластинки готовы к употреблению. Пластинки импрегнированные о-толидином хранят в эксикаторе. Используют при анализе кормов.
Пластинки "Силуфол" UV-254 производства ЧССР предварительно промывают дистиллированной водой в хроматографической камере, высушивают на воздухе и непосредственно перед использованием активизируют в сушильном шкафу при температуре 65° в течение 4 минут.
Подготовка хроматографических колонок для очистки экстрактов
Хроматографическая колонка для очистки от молочного жира. В нижнюю часть хроматографической колонки (размером 20 x 400 мм) помещают стекловату или 500 мг обезжиренной ваты. Затем засыпают в колонку силикагель АСК (75 мл для очистки экстрактов из проб свиного жира и 70 мл для всех остальных проб) и уплотняют силикагелъ постукиванием по колонке. Колонку промывают 50 мл н-гексана или петролейного эфира и прошедший через нее растворитель отбрасывают. После этого колонка готова для хроматографической очистки экстрактов из проб рыбы, мяса и мясопродуктов, молока и молокопродуктов, меда, яиц и т.д.
Хроматографическая колонка для очистки экстрактов из проб шротов (необогащенных липидами) и лузги.
Хроматографическую колонку заполняют на высоту 1 см стеклянной ватой, затем в колонку вносят просеянную окись алюминия (I) слоем 2,5 см или окись кремния - 3,5 см. Далее засыпают, не утрамбовывая, комочки окиси алюминия (кремния), пропитанные серной кислотой, высота слоя (II) 2,5 см. Каждый слой последовательно промывают гексаном (всего 20 - 30 мл).
Для анализа жмыхов и шротов, обогащенных липидами, слои окиси алюминия следует увеличить до 5 см (I) и 3 см (II) соответственно, в случае использования окиси кремния - 6 см (I) и 3 см (II).
2.5. Проведение определения
Вода, вино. 200 мл пробы помещают в делительную воронку и экстрагируют пестициды встряхивая в течение 3-х минут н-гексаном или петролейным эфиром тремя порциями по 30 мл или диэтиловым эфиром тремя порциями по 50 мл. В объединенные экстракты насыпают 10 г безводного сернокислого натрия или фильтруют через воронку, заполненную на 2/3 сернокислым натрием. Экстракты переносят в прибор для отгонки растворителей и отгоняют растворитель до объема 0,2 - 0,3 мл. В случае необходимости экстракт чистят серной кислотой.
Овощи, фрукты. 20 г измельченной пробы помещают в колбу с притертой пробкой и проводят экстрагирование пестицидов трижды в течение 15 минут на аппарате для встряхивания н-гексаном или петролейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенные экстракты сушат безводным сернокислым натрием, переносят в прибор для отгонки растворителей, отгоняют растворитель до объема 0,2 - 0,3 мл и наносят на пластинку.
Зерно, грибы. Из измельченных проб отбирают 20 г зерна, 50 г сырых или 10 г сухих грибов и помещают в колбы с притертыми пробками. Экстракцию пестицидов проводят трижды на приборе для встряхивания н-гексаном или петрилейным эфиром порциями по 30 мл. Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, прибавляют 10 мл насыщенного раствора безводного сернокислого натрия в серной кислоте и осторожно встряхивают несколько раз. Отделяют органический слой и повторяют обработку до тех пор, пока кислота не станет бесцветной. Экстракт промывают дистиллированной водой, сушат безводным сернокислым натрием и отгоняют растворитель.
Яблоки, капуста, трава, сено. 20 г измельченных яблок, 20 г капусты, 40 г травы и 20 г сена заливают 100 мл ацетона в колбе с притертой пробкой. Встряхивают 2 - 3 минуты, прибавляют 20 мл дистиллированной воды и охлаждают на льду 30 минут. Экстракт сливают и фильтруют холодным, экстракцию повторяют. Из объединенных водно-ацетоновых экстрактов отгоняют ацетон, а из водного остатка экстрагируют препараты н-гексаном тремя порциями по 10 мл в течение 10 минут. Гексановые экстракты очищают серной кислотой, насыщенной безводным сернокислым натрием. Сушат безводным сернокислым натрием. Отгоняют растворитель до небольшого объема и наносят на пластинку. Если очистка неполная (после испарения растворителей на колбе остается белый налет) экстракт испаряют досуха, остаток смывают холодным ацетоном 3 раза порциями по 0,2 мл и сразу наносят на пластинку.
Комбикорма. Для исследования берут навеску 40 г, увлажняют ее в колбе 60 мл дистиллированной воды. Увлажненную навеску оставляют на ночь в колбе, закрытой пробкой. Экстракцию пестицидов проводят дважды 50 - 100 мл смеси гексан-ацетон 1:1 при встряхивании в течение 2 часов. Экстракты объединяют в делительной воронке на 500 мл, прибавляют дважды по 50 мл дистиллированной воды и, после разделения слоев, нижний водный слой сливают в другую делительную воронку и экстрагируют пестициды 40 мл гексана. Водный слой сливают. Гексановые экстракты объединяют, фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сернокислым натрием. Экстракты упаривают на ротационном испарителе до объема 20 - 30 мл или досуха, растворяя затем сухой остаток в 20 - 30 мл гексана или петролейного эфира. Экстракт переносят в делительную воронку и производят очистку серной кислотой как описано выше.
Шрот, лузга, жмых. Навески: 15 г обогащенного липидами шрота или жмыха; 20 г не обогащенного липидами шрота или лузги делят на равные части и помещают в колбы емкостью 100 - 250 мл с притертыми пробками, заливают гексаном (три объема гексана на одну весовую часть шрота), встряхивают на приборе для встряхивания 30 минут. Экстракт фильтруют через воронку Бюхнера, не перенося осадок на воронку. В колбу повторно заливают указанное количество гексана, стряхивают 30 минут, фильтруют, количественно переносят осадок на воронку Бюхнера с помощью 30 мл гексана (3 раза по 10 мл). Полученный экстракт выпаривают до 30 мл на ротационном испарителе или в токе воздуха при температуре не выше 40°, остаток делят на две равные части и помещают в морозильную камеру холодильника на 1 час (не менее). Каждую часть пропускают через отдельную колонку с окисью алюминия со скоростью 2 мл/минуту промывают колбу и колонку 50 мл охлажденной смеси этилового эфира с гексаном (15:85). Эту операцию необходимо проводить без перерыва, не оставляя на следующий день. Очищенные экстракты объединяют и упаривают до объема 1 мл. Остаток из колбы переносят количественно микропипеткой с помощью резиновой груши в пробирку на 1 мл, колбу и микропипетку 2 - 3 раза промывают небольшим количеством гексана (всего 0,3 - 0,5 мл), сливая его в ту же пробирку. Затем осторожно выпаривают гексан из пробирки на водяной бане при температуре 50° почти досуха (конечный объем приблизительно 2 - 3 капли). Если общий объем экстракта и промывной жидкости превышает 1 мл, то сначала выпаривают экстракт, постепенно прибавляя к нему промывную жидкость. При наличии в упаренном экстракте белого мазеобразного осадка в пробирку добавляют 5 - 6 капель гексана и помещают ее на 15 - 20 минут в морозильную камеру холодильника, затем деканируют дважды таким же количеством гексана и снова упаривают до конечного объема 2 - 3 капли.
Параллельно с исследуемыми образцами готовят два модельных экстракта. Каждый экстракт получают из одного грамма шрота, не содержащего пестицидов (соотношение сухого вещества и пестицида те же, что и в исследуемых образцах). В один из экстрактов перед очисткой на колонках вносят микрошприцом (микропипеткой) определяемые пестициды в количестве 3 мкг, в другой - 0,75 мкг. Упаренные исследуемые и модельные экстракты с помощью микропипетки или микрошприца количественно наносят на пластинку, трижды смывая пробирку небольшим количеством гексана.
Рыба, мясо и мясопродукты. Мясо, мясопродукты пропускают через мясорубку. Рыбу очищают от чешуи, внутренних органов и тоже пропускают через мясорубку. 20 г пробы перемешивают с безводным сернокислым натрием и помещают в колбу с притертой пробкой. Пестициды экстрагируют дважды смесью гексан-ацетон или петролейный эфир-ацетон в соотношении 1:1 порциями по 50 мл в течение 1,5 часов при встряхивании. Экстракт фильтруют через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 безводным сернокислым натрием, затем растворитель отгоняют, сухой остаток растворяют в 20 мл н-гексана и вносят его в колонку с силикагелем АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 порциями по 25 - 30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу со шлифом емкостью 250 - 300 мл. Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью груши. Элюат отгоняют до объема 0,1 мл и наносят на хроматографическую пластинку.
В том случае, если пробы мяса или рыбы содержат большое количество жира, после испарения первого экстрагента (cмeси ацетона с гексаном) и растворения сухого остатка в гексане следует провести очистку гексанового экстракта серной кислотой, а затем колоночную очистку как описано выше.
Животный жир, яйца, яичный порошок. Жир измельчают на мясорубке, яичный порошок тщательно перемешивают, яйца - отделяют желток от белка, взвешивают желток и белок, а для анализа берут только желток. Конечный результат о содержании хлорорганических пестицидов в яйце приводят на все яйцо. Желток тщательно перемешивают.
25 г подготовленного образца заливают 50 мл ацетона, перемешивают и нагревают на горячей водяной бане до закипания растворителя. Колбу охлаждают, добавляют в нее 10 мл охлажденного 2% раствора сернокислого натрия, перемешивают и охлаждают 45 минут на ледяной бане. Затем сливают ацетоновый слой в круглодоннную колбу через слой обезжиренной ваты. Экстракцию ацетоном с последующим вымораживанием жира повторяют еще два раза. Из объединенных экстрактов отгоняют ацетон на ротационном испарителе или в приборе для отгонки растворителей (температура бани не более 70°+- 2°) и трижды экстрагируют петролейным эфиром порциями 20, 10 и 10 мл. Продолжительность первой экстракции 1 час, последующих 15 минут. Петролейный эфир переносят в делительную воронку с 40 мл 2% водного раствора сернокислого натрия, перемешивают содержимое в течение 2-х минут, дают слоям разделиться и водную фазу отбрасывают. Для улучшения разделения слоев можно добавить несколько мл насыщенного раствора сернокислого натрия. Операцию промывки экстракта повторяют еще два раза, после чего петролейный эфир сливают в стакан с 20 г безводного сернокислого натрия, споласкивают делительную воронку дважды 5 мл петролейного эфира. Подсушеный экстракт количественно переносят в мерный цилиндр на 50 мл и доводят объем раствора петролейным эфиром до 30 мл. Далее наносят 30 мл экстракта в колонку с силикагелем АСК как указано выше. Для проб свиного жира насыпают 75 мл силикагеля АСК, для всех остальных проб - 70 мл. Очистку экстрактов проводят как описано для проб мяса. Элюат собирают в круглодонную колбу на 150 мл, растворитель упаривают до объема нескольких капель и наносят на хроматографическую пластинку.
Мед. 30 г меда смешивают с 3 г безводного сернокислого натрия и трижды экстрагируют пестициды гексаном порциями по 30 мл каждый раз по 15 минут, тщательно растирая мед стеклянной палочкой в узком химическом стакане. Экстракты объединяют и отгоняют гексан до объема 30 мл или до меньшего объема, далее доводя экстракт до 30 мл гексаном. 30 мл экстракта вносят в хроматографическую колонку с силикагелем АСК и проводят очистку экстракта и испарение растворителя как описано выше.
Сахар. Из навески 50 г сахара, предварительно растворенного в воде, пестициды экстрагируют в делительной воронке на 250 мл н-гексаном. Экстракцию пестицидов проводят трижды по 50, 25 и 25 мл растворителя каждый раз встряхивая по 5 минут. Объединенные гексановые экстракты очищают от коэкстрактивных веществ (красящие, аминокислоты, липиды) сернокислотным способом.
Молоко и молочные продукты. Для подготовки проб можно использовать один из приведенных способов.
Первый способ. Сливки, сметана, молоко и др. цельномолочные продукты. Для анализа берут 20 г сливок и сметаны, предварительно разведенных равным объемом дистиллированной воды, 50 мл молока, кефира и т.п. прибавляют концентрированную серную кислоту (30 - 40 мл) до полного почернения пробы. Охлажденный до 10 - 15° раствор переносят в делительную воронку и экстрагируют препараты гексаном 2 раза порциями по 25 мл. Для полного извлечения воронку встряхивают 2 минуты, затем оставляют ее на 30 минут до полного разделения слоев. Если образуется эмульсия, прибавляют 1 - 2 мл этилового спирта. К объединенным экстрактам в делительной воронке прибавляют 10 мл концентрированной серной кислоты, насыщенной сернокислым натрием, и осторожно встряхивают несколько раз. Очистку продолжают до получения бесцветной серной кислоты.
Творог, сыр. 50 г творога или 10 г измельченного на терке сыра заливают 40 мл гексана или петролейного эфира, непрерывно всряхивают 2 - 3 минуты и оставляют на 30 минут. Экстракцию повторяют. Объединенные экстракты в делительной воронке очищают серной кислотой, как указано выше.
Второй способ. Молоко, кефир, простокваша, кумыс и другие цельномолочные продукты. 25 мл продукта помещают в делительную воронку на 300 мл приливают по 5 мл щавелевокислого калия и насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают, приливают 100 мл ацетона, встряхивают 2 минуты. Приливают 100 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронку оставляют до полного разделения слоев. Верхнюю фазу отбрасывают, а нижнюю выливают в круглодонную колбу со шлифом и испаряют растворитель досуха. Остаток смывают 30 мл гексана.
Сгущенное молоко, 10 - 20% сливки. К 10 г продукта прибавляют 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и выливают в делительную воронку вместимостью 150 мл. К смеси приливают 40 мл ацетона, встряхивают 2 минуты, приливают 60 мл хлороформа, встряхивают 2 - 3 минуты и оставляют до разделения фаз. Далее поступают, как при определении пестицидов в молоке.
Сгущенные молочные продукты. 10 г продукта помещают в стаканчик, заливают 10 мл вода с температурой 45 - 50°С, перемешивают и переносят в делительную воронку на 150 мл, добавляют 5 мл щавелево-кислого калия. Содержимое воронки перемешивают, приливают 80 мл ацетона и встряхивают 2 - 3 минуты. Добавляют 100 мл хлороформа и встряхивают 5 - 7 минут. После разделения фаз, нижнюю фазу сливают в круглодонную колбу, растворители отгоняют, а сухой остаток растворяют в 30 мл петролейного эфира.
Сухие молочные продукты. 3 г сухих молочных продуктов (сливок 2 г) высыпают в стаканчик, приливают 15 мл дистиллированной воды с температурой 40 - 45°С, размешивают и переносят в делительную воронку вместимостью 300 мл, приливают по 5 мл щавелевокислого калия и насыщенного раствора хлористого натрия. Содержимое воронки перемешивают, добавляют 80 мл ацетона и встряхивают 3 - 5 минут, приливают 100 мл хлороформа, встряхивают 5 минут и оставляют на 3 - 5 минут (до разделения фаз). Нижнюю фазу сливают в круглодонную колбу, растворитель отгоняют, а остаток смывают 30 мл гексана.
Сметана, 30 - 40% сливки. 5 г продукта отвешивают в стаканчик, приливают 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку вместимостью 150 мл. Стаканчик обмывают 40 мл ацетона, смывы переносят в делительную воронку, которую встряхивают 2 - 3 минуты, добавляют 70 мл хлороформа и встряхивают 2 мин. Воронку оставляют на несколько минут до разделения фаз, нижнюю фазу сливают в колбу для отгонки растворителей, растворитель отгоняют, а остаток смывают 30 мл гексана.
Творог, сыр. 10 г творога или измельченного на терке сыра растирают с 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят в делительную воронку на 250 - 300 мл. Прибавляют 80 мл ацетона, встряхивают 2 минуты, приливают 100 мл хлороформа и вновь встряхивают. Нижнюю фазу используют для анализа после отгонки растворителей, растворив остаток в 30 мл гексана.
Далее проводят очистку экстрактов из проб молока и молочных продуктов от молочного жира подготовленных по второму способу. Для этого 30 мл экстракта наносят в колонку с 70 мл силикагеля АСК. После впитывания экстракта в сорбент пестицид элюируют 110 мл смеси бензола с гексаном в соотношении 3:8 порциями по 25 - 30 мл. Элюат собирают в круглодонную колбу на 250 - 300 мл. Через 10 минут после впитывания последней порции растворителя сорбент отжимают с помощью резиновой груши. После очистки растворители отгоняют под вакуумом.
Сливочное масло. 20 г сливочного масла растапливают на водяной бане в круглодонной колбе, прибавляют 50 мл ацетона, тщательно перемешивают до растворения жира, прибавляют 10 мл ледяной дистиллированной воды и охлаждают на льду до затвердевания жира (примерно 30 минут). Сливают ацетоновый экстракт и процедуру повторяют еще 2 раза. Из объединенных экстрактов в круглодонной колбе ацетон отгоняют на водяной бане. Пестициды экстрагируют из оставшегося водного экстракта гексаном тремя порциями по 10 мл в течение 5 минут. Объединенные гексановые экстракты в делительной воронке обрабатывают серной кислотой с сернокислым натрием. Очищенный экстракт сушат безводным сернокислым натрием и упаривают.
Почва. К навескам воздушно-сухой почвы (10 г), помещенным в конические колбы емкостью 250 мл приливают 10 мл 1%-ного водного раствора хлористого аммония и оставляют на сутки закрытыми. Затем приливают смесь 30 мл ацетона и 30 мл гексана и встряхивают колбы в течение часа на встряхивающем устройстве. Содержимое колб переносят в центрифужные пробирки. После центрифугирования жидкую часть сливают в конические колбы, почву с помощью 10 мл 1%-ного раствора хлористого аммония и 30 мл ацетона переносят в исходные конические колбы, добавляют 30 мл гексана и проводят экстракцию еще в течение 30 минут. Затем экстракты объединяют. К объединенным экстрактам в делительной воронке приливают 180 мл дистиллированной воды, осторожно встряхивают в течение 5 - 7 минут, дают жидкостям расслоится и нижний водный слой сливают в коническую колбу. Гексановый слой пропускают через безводный сульфат натрия (столовая ложка или 30 - 40 г сульфата натрия).
Из водно-ацетонового слоя экстракцию пестицидов проводят еще дважды 15 и 10 мл гексана, который затем сушат через тот же сульфат натрия. Гексановые экстракты объединяют.
Концентрирование экстрактов проводят либо на ротационно-вакуумном испарителе, либо при температуре бани не более 40°С и времени отгонки 9 - 11 минут, либо из колбочек с г-образным отводом при температуре водяной бани 72 - 75°С.
Очистку сконцентрированных гексановых экстрактов из проб почв проводят серной кислотой, как описано выше для других проб, и испаряют растворитель.
Табак и табачные изделия. 5 г табака помещают в стеклянный стакан на 500 мл, заливают 50 мл концентрированной серной кислоты и стеклянной палочкой тщательно размешивают до полного равномерного обугливания пробы. Спустя 10 - 15 минут в колбу добавляют 25 мл гексана, тщательно размешивают содержимое и прибавляют 20 мл четыреххлористого углерода. Экстракцию пестицидов из пробы проводят в течение 15 минут трижды, после чего экстракт последовательно переносят в делительную воронку для однократной или двукратной дополнительной очистки серной кислотой.
Хроматографирование
На хроматографическую пластинку на расстоянии 1,5 см от ее края шприцем или пипеткой наносят исследуемую пробу в одну точку так, чтобы диаметр пятна не превышал 1 см. Остаток экстракта в колбочке смывают тремя порциями (по 0,2 мл) диэтилового эфира, которые наносят в центр первого пятна. Справа и слева от пробы на расстоянии 2 см наносят стандартные растворы, содержащие 10, 5, 1 мкг исследуемых препаратов (или другие количества близкие к определяемым концентрациям).
Пластинки с нанесенными растворами помещают в камеру для хроматографирования, на дно которой за 30 минут до начала хроматографирования наливают подвижный растворитель. При использовании пластинок с тонким слоем окиси алюминия или силикагеля в качестве подвижного растворителя применяют н-гексан или смесь гексана с ацетоном в соотношении 6:1, для препаратов, у которых величина R_f в гексане ниже 0,3. При использовании пластинок "Силуфол" подвижный растворитель - 1% раствор ацетона в гексане, а пластинок "Силуфол" - импрегнированных о-толидином - гексан с диэтиловым эфиром в соотношении 49:1. Край пластинки с нанесенными растворами может быть погружен в подвижный растворитель не более чем на 0,5 см.
После того как фронт растворителя поднимется на 10 см, пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут для испарения растворителя. Далее пластинку орошают проявляющим реактивом и подвергают действию УФ света в течение 10 - 15 минут (лампа ПРК-4). Пластинки следует располагать на расстоянии 20 см от источника света.
При наличии хлорорганических пестицидов на пластинке появляются пятна серо-черного цвета.
При использовании для анализа пластинок "Силуфол", импрегнированных о-толидином, их непосредственно после хроматографирования подвергают УФ-облучению в течение нескольких минут. При наличии хлорорганических пестицидов в этом случае появляются пятна сине-голубого цвета.
Количественное определение осуществляют сравнением площадей пятен пробы и стандартных растворов. Между количеством препарата в пробе, не превышающем 20 мкг, и площадью его пятна на пластинке существует прямая пропорциональная зависимость. При большем содержании препарата следует использовать пропорциональную часть исследуемого экстракта.
2.6. Обработка результатов анализа
Количество препарата в пробе вычисляют по формуле:
А S
2
Х = - --
P S
1
где X - содержание препарата в пробе, мг/кг или мг/л,
A - содержание препарата в стандартном растворе, мкг
S - площадь пятна стандартного раствора, мм2
1
S - площадь пятна пробы, мм2
2
Р - масса или объем исследуемой пробы, г или мл
3. Требования безопасности
Соблюдаются требования безопасности обычно рекомендуемые для работы с химическими реактивами и хлорорганическими пестицидами.
Таблица 3.
Величина R_f хлорорганических пестицидов
----------------------T--------------------------T-----------------------
Пестицид ¦ Подвижный растворитель ¦ Величина R_f
¦ +-----------------------
¦ ¦ на окиси на
¦ ¦ алюминия силикагеле
----------------------+--------------------------+-----------------------
Гексахлорбензол Гексан 0,9 -
Альдрин Гексан 0,83 0,68
ДДЭ -"- 0,78 0,66
ДДЭ Гексан + ацетон (6:1) 0,87 -
Гептахлор Гексан 0,76 0,65
2,4-ДДТ - " - 0,67 0,54
4,4'-ДДТ - " - 0,61 0,50
4,4'-ДДТ Гексан + ацетон (6:1) 0,75 -
Линдан Гексан 0,34 0,20
ДДД - " - 0,30 0,40
ДДД Гексан + ацетон (6:1) 0,62 -
Метоксихлор Гексан 0,15 -
Метоксихлор Гексан + ацетон (6:1) 0,60 -
Кельтан Гексан 0,05 -
Кельтан Гексан + ацетон (6:1) 0,40 -
Кельтан Бензол 0,44 -
Тедион Гексан 0,03 -
Тедион Гексан + ацетон (6:1) 0,55 -
Эфирсульфонат Гексан 0, -
Эфирсульфонат Гексан + ацетон (6:1) 0,45 -
Дактал То же (2:1) 0,9 -
Заместитель Главного государственного
санитарного врача СССР
А.И. Заиченко
