< < Обновление, архив

Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96 "4. Методы контроля. Медицинские иммунобиологические препараты. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям" (утв. заместителем Главного государственного санитарного врача РФ 31 октября 1996 г.)

Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года

Страница 1

Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4

Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96
"Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов,
вводимых людям"
(утв. заместителем Главного государственного санитарного врача РФ
31 октября 1996 г.)

Дата введения - с момента утверждения

Testing of injectable medical immunobiological preparations

 
 1.  Область применения                                                  
 2.  Нормативные ссылки                                                  
 3.  Общие положения                                                     
 4.  Термины и определения                                               
 5.  Определение   электрофоретической   чистоты  и   молекулярных  масс 
     геноинженерных препаратов                                           
 6.  Контроль  содержания  примесей  клеточных  ДНК в биотехнологических 
     препаратах                                                          
 7.  Испытание на стерильность                                           
 8.  Испытание на токсичность                                            
 9.  Испытание на пирогенность                                           
 10. Определение эндотоксина в тесте с лизатом амебоцитов                
 11. Испытание на отсутствие посторонних агентов                         
 12. Контроль качества герметизации  ампул  и  флаконов  с  медицинскими 
     иммунобиологическими препаратами                                    
 13. Определение остаточного кислорода в  ампулах  и  флаконах  с  МИБП, 
     герметизированных после заполнения защитным газом                   
 14. Определение белкового азота с реактивом Несслера                    
 15. Определение общего азота с реактивом Несслера                       
 16. Определение белка с биуретовым реактивом                            
 17. Определение белка по методу Лоури                                   
 18. Определение аминного азота формольным титрованием                   
 19. Определение сахаров с антроновым реактивом                          
 20. Определение О-ацетильных групп                                      
 21. Определение фосфора                                                 
 22. Определение нуклеиновых кислот по методу Спирина                    
 23. Определение   однородности    сывороточных    препаратов    методом 
     электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы                       
 24. Определение антигенного  состава  сывороточных  препаратов  методом 
     иммуноэлектрофореза                                                 
 25. Определение  агрегатов  и  фрагментов  в препаратах иммуноглобулина 
     методом гель-фильтрации                                             
 26. Определение  агрегатов в  препаратах иммуноглобулина  с применением 
     полиэтиленгликоля                                                   
 27. Определение молекулярных параметров полисахаридов                   
 28. Определение  степени  расщепления  белковых  препаратов  по наличию 
     низкомолекулярных фракций, неосаждаемых трихлоруксусной кислотой    
 29. Определение примеси протеолитических ферментов в иммуноглобулинах   
 30. Определение  содержания  бычьего  сывороточного   альбумина методом 
     ракетного иммуноэлектрофореза                                       
 31. Определение фенола                                                  
 32. Определение формальдегида                                           
 33. Определение мертиолята                                              
 34. Определение гидроксиламина                                          
 35. Определение остаточного спирта                                      
 36. Определение остаточного риванола                                    
 37. Определение натрия хлорида                                          
 38. Определение ионов алюминия                                          
 39. Определение сульфат-ионов                                           
 40. Определение ионов аммония                                           
 41. Определение гликокола                                               
 42. Определение  показателя   дисперсности   сорбента  и  сорбированных 
     препаратов                                                          
 43. Определение потери в массе при высушивании                          
 44. Определение точности розлива в лиофилизированных препаратах         
 45. Определение прозрачности и цветности                                
 46. Определение рН                                                      
 47. Определение равномерности розлива сорбированных препаратов          
 48. Методика  контроля  жидких  инъекционных   МИБП   на   механические 
     включения                                                           
 49. Методика  контроля  на  механические  включения   сухих   МИБП  для 
     палентерального введения, применяемых в виде раствора               
 

1. Область применения

Настоящие методические указания предназначены для работников предприятий, осуществляющих контроль качества вакцин, анатоксинов, сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов, эубиотиков и других иммунобиологических препаратов, вводимых людям.

Все положения настоящего документа распространяются на предприятия, производящие МИБП, независимо от их ведомственной принадлежности и формы собственности.

2. Нормативные ссылки

2.1. Вакцинопрофилактика СП 3.1.1.95.

2.2. Приказ Министерства здравоохранения СССР от 13.01.83 N 31.

2.3. Производство и контроль медицинских иммунобиологических препаратов для обеспечения их качества.

3. Общие положения

3.1. Целью введения настоящих методических указаний является регламентация методов контроля медицинских иммунобиологических препаратов на их соответствие требованиям нормативной технической документации и, прежде всего. Фармакопейной статьи (Временной фармакопейной статьи).

3.2. Задачей проведения общих методов контроля является преимущественно установление безопасности МИБП, вводимых людям.

3.3. Методические указания содержат описание общих методов контроля МИБП, вводимых людям. Особенности контроля качества МИБП, не охватываемые настоящим документом, описаны в нормативно-технической документации на эти препараты.

4. Термины и определения

4.1. Биологические термины и определения

4.1.1. Медицинские иммунобиологические препараты, вводимые людям - вакцины, анатоксины, иммуноглобулины, сыворотки, аллергены, эубиотики и другие лекарственные средства, предназначенные для иммунопрофилактики, иммунотерапии и иммунодиагностики инфекционных заболеваний и аллергических состояний.

4.1.2. Качество МИБП - совокупность свойств продукции, обусловливающих ее способность удовлетворять определенные потребности в соответствии с ее назначением.

4.1.3. Готовая серия препарата - совокупность емкостей, полученных из одного готового к розливу полуфабриката, разлитых из одной емкости.

4.2. Химические термины и определения

4.2.1. Концентрация. Концентрация растворов в весобъемных процентах. Например, для приготовления 10%-ного раствора следует брать 10 г вещества и растворителя для получения 100 мл раствора.

4.2.2. Точная навеска. Взвешивание на аналитических весах с точностью до 0,0002 г. Если не указано "точная навеска", то навеску берут с точностью до 0,01 г.

4.2.3. Постоянная масса. Разница в массе между последовательными взвешиваниями, не превышающая 0,0005 г.

4.2.4. Растворитель - дистиллированная вода, если нет других указаний.

4.2.5. Оценка результатов. Расчет результатов на основании 2-х параллельных определений.

4.2.6. Квалификация реактивов. Для анализа используют реактивы квалификации х.ч. и ч.д.а.

4.2.7. Моющее средство. Хромовая смесь для обработки посуды - (5 %-ный раствор калия дихромата в концентрированной серной кислоте).

4.2.8. Контрольный опыт. Определение, проводимое с теми же количествами реактивов в тех же условиях, но без испытуемого препарата. Вместо испытуемого препарата используется растворитель.

4.2.9. Хранение растворов. Хранение растворов реактивов при температуре 18-20°С в течение 6 мес., если нет изменений их физических свойств.

4.2.10. Спирт - этиловый ректификованный, содержащий 96% спирта (по массе).

5. Определение электрофоретической чистоты
и молекулярных масс геноинженерных препаратов

Метод используется для анализа геноинженерных продуктов, а также некоторых высокоочищенных биотехнологических препаратор, предназначенных для введения людям.

Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы геноинженерных продуктов применяют метод вертикального электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в редуцирующих и нередуцирующих условиях с последующей окраской геля как Кумасси ярко-голубым R-250, так и нитратом серебра. Образование комплекса SDS с белком устраняет различия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы белка. При соблюдении этих условий подвижность белков отражает их молекулярные массы.

Испытания проводят на полуфабрикате препарата (очищенного продукта) до добавления каких-либо стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.

Электрофорез проводят в редуцирующих (в присутствии Бета-меркаптоэтанола) и нередуцирующих (в отсутствии бета-меркаптоэтанола) условиях. Определение молекулярных масс геноинженерных белков проводят при окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 с нагрузкой на лунку 10 мкг, а определение чистоты - при нагрузке 40 мкг.

Параллельно, для оценки содержания примесей как белковой, так и небелковой природы, проводят электрофорез в редуцирующих условиях при окрашивании нитратом серебра с нагрузкой на лунку 2-5 мкг белка.

Методика определения. Полимеризацию геля ведут в ячейке, образованной стеклами и прокладками, определяющими размер и толщину геля. Сборку ячейки проводят в соответствии с инструкцией по работе с конкретным типом прибора для вертикального электрофореза. Описание метода проводится на примере аппарата "Протеан 11" фирмы "Био-Рад", США. Для данного прибора размеры стекол ячейки составляют: внешнее стекло - 22 х 20 см, внутреннее стекло - 20 х 20 см. Размеры прокладок: длина 20 см, ширина - 18 см, толщина - 0,75-1,0 мм. При наличии приборов с другими характеристиками необходимо внести соответствующие коррективы в постановку испытаний.

Проведение электрофореза

Нижнюю камеру аппарата для электрофореза заполняют электродным буферным раствором и вставляют в нее электрофоретическую ячейку с гелем. Верхний резервуар заполняют электродным буферным раствором, удаляют из лунок пузырьки воздуха. Под слой буферного раствора в лунку вносят исследуемые образцы. Электрофорез проводят при температуре 10-14°С в режиме постоянного тока. При прохождении фронта красителя через концентрирующий гель сила тока составляет 10-12,5 мА на 1 см2 сечения геля (20-25 мА/гель). После вхождения фронта красителя в нижний разделяющий слой на 5-7 мм силу тока увеличивают до 20 мА на 1 см2 сечения геля (40 мА/гель). После продвижения красителя на 14 см от нижнего края концентрирующего геля ток отключают, отделяют гель от стекол ячейки и переносят в кювету для окрашивания. Для того, чтобы можно было выявить присутствие в исследуемом образце агрегатов и других компонентов, не входящих в гель, концентрирующий гель полностью не обрезают, оставляя 0,5-10 мм. В случае необходимости можно обрезать часть нижнего геля по фронту красителя. Нанесение образцов на гель проводят в следующем порядке. В лунки 1 и 10 вносят соответствующий (с бета-меркаптоэтанолом или без) буфер для приготовления образцов, разбавленный деионизованной водой в 4 раза. В лунки 2 и 9 вносят по 7 мкл смеси стандартных белков, например, фирмы "Фармация", Швеция. В остальные лунки вносят исследуемые образцы. При окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 вносят попарно такие объемы образца, чтобы количество белка в них составляло соответственно 10 и 40 мкг. При окрашивании геля нитратом серебра, в зависимости от препарата, в лунки вносят 2-5 мкг белка. Параллельно, в одну из лунок вносят 0,002-0,01 мкг белка (в зависимости от чувствительности выявления минимальных количеств белка в данных условиях).

Окрашивание геля

1. Окрашивание Кумасси ярко-голубым R-250. Гель фиксируют 1 ч в фиксирующем растворе, после чего окрашивают в течение 16 ч. Затем окрашивающий раствор сливают, гель 2-3 раза споласкивают обесцвечивающим раствором и помещают в аппарат для обесцвечивания, заполненный обесцвечивающим раствором. Обесцвечивание проводят в течение 15 мин при напряжении 24 В. Гель вынимают из аппарата для обесцвечивания и споласкивают раствором для обесцвечивания и деионизованной водой.

2. Окрашивание нитратом серебра. Окрашивание геля нитратом серебра проводят с использованием коммерческого набора реагентов (фирмы "Био-Рад", США, или других) согласно прилагаемой инструкции. Следует обратить внимание на время выдерживания геля в проявляющем растворе. Окрашивание прекращают в момент проявления полосы в лунке с минимальным количеством препарата (например, 0,005 мкг).

Высушивание геля

В кювету наливают 0,5 л раствора для высушивания геля, помещают лист целлофановой диализной мембраны, например, фирмы "Фармация", Швеция. На нем размещают гель и сверху накрывают вторым листом целлофановой диализной мембраны. Кювету закрывают крышкой и помещают на качалку. При покачивании гель выдерживают 20-30 минут. Стекло смачивают раствором для высушивания геля и на него плотно, без пузырьков воздуха, натягивают смоченный лист целлофановой диализной мембраны, на нее помещают гель. Сверху плотно, без пузырьков воздуха прикрывают вторым смоченным листом целлофановой диализной мембраны. Закрепляют и оставляют на столе при комнатной температуре не менее, чем на 18-20 ч. Высушенный гель снимают со стекла вместе с целлофановой диализной мембраной и аккуратно обрезают. Гель готов для проведения денситометрии и оценки результатов.

Денситометрия окрашенного геля

Проводится денситометром фирмы ЛКБ, Швеция, или другим не меньшей чувствительности. Денситометрию проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации данного прибора от верхнего края нижнего разделяющего геля по пути пробега белков в данной лунке. В зависимости от конструкции аппарата может проводиться денситометрия влажного и высушенного геля. Для учета фона геля может денситометрироваться дорожка с нанесенным буферным раствором для образцов, разбавленным деионизованной водой в 4 раза (в нашем примере дорожки 1 и 10). Площадь интегрирования самого большого зарегистрированного пика является нижним пределом для денситометрии анализируемых образцов. Однако, при этом на дорожках с буферным раствором не должны обнаруживаться окрашенные полосы.

Определение молекулярных масс геноинженерных белков

Молекулярные массы мономеров и олигомеров исследуемого продукта определяют на электрофореграмме, полученной после окрашивания Кумасси ярко-голубым R-250 в редуцирующих условиях при нагрузке на лунку 10 мкг белка. Для этого измеряют расстояние от верхнего края нижнего разделяющего геля до белковых зон стандартных белков (дорожки 2 и 9) - величина Rбелка. Таким же образом определяют расстояние пробега красителя (величина Rстандарт). Для каждого стандартного белка определяют коэффициент подвижности (Ra) по формуле:

 
            Rбелка
     Ra = -----------
           Rстандарт
 

Строят график зависимости Ra стандартного белка от логарифма молекулярной массы стандартного белка. Затем определяют Ra для каждой белковой зоны исследуемого образца и по калибровочному графику определяют логарифмы молекулярной массы, из которых рассчитывают молекулярную массу соответствующих белков.

Оценка результатов электрофореза

После завершения электрофореза исследуемые образцы не должны содержать неидентифицированных продуктов или их агрегатов в лунках гребенки геля или на границе при вхождении в гель. Для количественной оценки процента содержания целевого белка, его олигомеров, фрагментов и примесей проходят сканирование геля при помощи денситометра. Содержание геноинженерного продукта в редуцирующих условиях при окрашивании Кумасси ярко-голубым R-250 должно быть не менее 95%. Требования к другим параметрам (относительное содержание мономеров, олигомеров, фрагментов, белковых и небелковых примесей, чистота и картина дорожки на электрофореграмме в нередуцирующих условиях и при окрашивании нитратом серебра) определяются характеристиками и назначением конкретных исследуемых препаратов и указываются в частных фармакопейных статьях.

Примечания.
I. Приготовление нижнего разделяющего геля.

1. Для приготовления 15%-ного геля в химический стакан, емкостью 100 мл. наливают 25 мл 30%-ного раствора акриламидо/бисакриламида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л рН 8,8, 11,75 мл деионизованной воды и 500 мкл 10%-ного раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору прибавляют 250 мкл 10%-ного раствора ПСА и 25 мкл TEMED. перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.

2. Для приготовления 12%-ного геля в химический стакан, емкостью 100 мл, наливают 20 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 12,5 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1,5 моль/л рН 8,8, 16,75 мл деионизованной воды и 500 мкл 10%-ного раствора SDS. Полученный раствор дегазируют 15 мин под вакуумом в колбе Бунзена. К дегазированному раствору добавляют 250 мкл 10%-ного раствора ПСА и 25 мкл TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку.

Мениск раствора в ячейке должен находиться на расстоянии 3-4 см от верхнего края внутреннего стекла. На раствор в ячейке наслаивают 1,0 мл деионизованной воды так, чтобы гель и вода не перемешивались. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 1820°С. Сначала граница между гелем и водой размывается, а затем становится резкой. Это является моментом окончания полимеризации.

II. Приготовление верхнего концентрирующего геля.

После окончания полимеризации нижнего разделяющего геля, воду сливают, поверхность геля тщательно подсушивают с помощью фильтровальной бумаги и заливают в ячейку 4%-ный раствор верхнего концентрирующего геля. Для его приготовления в химический стакан, вместимостью 50 мл, наливают 1,3 мл 30%-ного раствора акриламида/бисакриламида, 2,5 мл раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 6,1 мл деионизованной воды и 100 мкл 10%-ного раствора SDS. Раствор дегазируют под вакуумом в колбе Бунзена 15 мин. К дегазированному раствору добавляют 50 мкл 10%-ного раствора ПСА, 10 мкл TEMED, перемешивают и заливают в электрофоретическую ячейку. После этого в ячейку вставляют гребенку с необходимым (например, десятью) количеством зубьев и толщиной, равной толщине прокладки. Полимеризация геля происходит в течение 30-40 мин при температуре 18-20°С. После завершения полимеризации гребенку удаляют и промывают образовавшиеся лунки 1 раз деионизованной водой и 10 раз электродным буферным раствором.
III. Приготовление растворов.

1. Электродный буферный раствор (5х) рН 8,3.

45,0 г трис (гидроксиметил) аминометана, 216,0 г глицина, 15,0 г SDS помещают в градуированный стакан, прибавляют 2000,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем деионизованной водой до 3000,0 мл, фильтруют, измеряют рН, который должен быть в пределах 8,3. Доводить рН раствора кислотой или щелочью до необходимого значения не допускается.

2. Электродный буферный раствор рН 8,3.

К 600,0 мл электродного буферного раствора (5х) прибавляют 2400,0 мл деионизованной воды и перемешивают.

3. 30%-ный раствор акриламида/бисакриламида.

29,20 г акриламида и 0.80 г бисакриламида помещают в градуированный химический стакан и прибавляют 80,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения, доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в темной посуде при 4-6°С не более месяца.

4. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1,5 моль/л, рН 8,8.

54,450 г трис (гидроксиметил) аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 150,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 8,8 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 300,0 деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение месяца при 4-6°С.

5. Буферный раствор трис-HCl концентрации 0,5 моль/л, рН 6.8.

6,0 г трис (гидроксиметил) аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 60,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 6,8 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят в течение месяца при 4-6°С.

6. 10%-ный раствор SDS.

10,0 г додецилсульфата натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 80,0 мл деионизованной воды и тщательно перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Хранят при температуре 18-25°С.

7. 10%-ный раствор ПСА.

100,0 мг аммония персульфата растворяют в 1,0 мл деионизованной воды. Используется только свежеприготовленный раствор.

8. 0,5%-ный бромфеноловый синий.

0,25 г бромфенолового синего разводят в 50,0 мл деионизованной воды до полного растворения. Раствор хранят при температуре 18-25°С.

9. Раствор для приготовления образцов при проведении электрофореза в нередуцирующих условиях.

В химический стакан помещают 4,2 мл деионизованной воды, 1,0 мл буферного раствора трис НСl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10%-ного раствора SDS, 0,4 мл 0,5%-ного раствора бромфенолового синего. Раствор тщательно перемешивают и хранят при температуре 18-25°С.

10. Раствор для приготовления образцов при проведении электрофореза в редуцирующих условиях.

В химический стакан помещают 3,8 мл деионизованной воды, 1,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 0,5 моль/л рН 6,8, 0,8 мл глицерина, 1,6 мл 10%-ного раствора SDS, 0,4 мл бета-меркаптоэтанола, 0,4 мл 0,5%-ного раствора бромфенолового синего. Раствор тщательно перемешивают и хранят при температуре 18-25°С.

11. Образец исследуемого препарата смешивают в соотношении 3:1 с раствором для проведения электрофореза в нередуцирующих условиях или с раствором для проведения электрофореза в редуцирующих условиях. Смесь прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 или 10 мин (в зависимости от исследуемого белка) и охлаждают до температуры 18-25°С.

12. Приготовление раствора стандартных белков для электрофореза.

Смесь стандартных белков для электрофореза ("Фармация", Швеция, или подобные другие) с соответствующим для данного исследования диапазоном молекулярных масс (например, от 14400 до 94000) растворяют в 100 мкл разбавленного в 4 раза раствора для приготовления образцов при проведении электрофореза в редуцирующих условиях или в 100 мкл разбавленного в 4 раза раствора для приготовления образцов для проведения электрофореза в нередуцирующих условиях. Раствор прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин и охлаждают до температуры 18-25°С. Разливают аликвоты и хранят при (-20°С).

13. Фиксирующий раствор.

В химический стакан наливают 250.0 мл этилового спирта, 100,0 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют деионизованной воды до объема 1000,0 мл. Хранят при температуре 18-25°С.

14. Окрашивающий раствор.

1,0 г Кумасси ярко-голубого R-250 помещают в химический стакан, доводят до объема 250,0 мл этиловым спиртом, перемешивают не менее 3,5 часов до полного растворения красителя, добавляют 100,0 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем деионизованной водой до 1000,0 мл. Хранят при температуре 18-25°С.

15. Обесцвечивающий раствор.

В химический стакан наливают 250,0 мл этилового спирта, 100.0 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем деионизованной водой до 1000 мл.

16. Раствор для высушивания геля.

В химический стакан наливают 150,0 мл этилового спирта, 50,0 мл глицерина, перемешивают и доводят объем деионизованной водой до 500,0 мл.

Хранят при температуре 18-25°С.

17. При отборе проб и растворов используют автоматические пипетки с соответствующими диапазонами объемов:

- от 1 мкл до 10 мкл;

- от 5 мкл до 40 мкл;

- от 40 мкл до 200 мкл;

- от 200 мкл до 1000 мкл;

- от 1 мл до 5мл.

6. Контроль содержания примесей клеточных ДНК
в биотехнологических препаратах

Настоящему испытанию подлежат геноинженерные препараты, моноклональные антитела и биотехнологические продукты, получаемые на перевиваемых клеточных линиях, предназначенные для введения людям. В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая их специфические характеристики и особенности производства, возможно внесение соответствующих изменений при проведении данного контроля.

Испытание проводят на полуфабрикате препарата (очищенного продукта) до добавления каких-либо стабилизаторов, наполнителей, консервантов и других компонентов, которые могут входить в состав конечной лечебной формы.

Выделение ДНК из клеток штамма продуцента

1 г биомассы клеток штамма продуцента суспендируют в 20 мл буфера ТЕ, добавляют 10%-ный раствор додецилсульфата натрия (SDS) до конечной концентрации 1%, лизируют в течение 15 мин, перемешивая. К полученному лизату добавляют равный объем смеси фенол-хлороформ (1:1). Смесь встряхивают в течение 15 мин, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, собирают верхний слой (без интерфазы) и повторяют экстракцию фенол-хлороформом еще дважды. Собирают верхний слой, добавляют раствор 5 моль/л ацетата аммония до конечной концентрации 0,25 моль/л и 2 - 2,5 объема охлажденного до (-20°С) этилового спирта. Полученную смесь оставляют на 1 час при (-20°С) (можно оставить на ночь - 14-16 часов), затем центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин. Этиловый спирт сливают, осадок подсушивают на воздухе и растворяют в 1,5 мл буфера ТЕ. К раствору ДНК добавляют раствор РНКазы (10 мг/мл) до конечной концентрации 50 мкг/мл. Смесь выдерживают при периодическом помешивании в течение одного часа при 37°С, после чего к ней добавляют сухую лиофилизированную протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/мл. Смесь инкубируют, периодически помешивая, в течение 30 мин при 37°С, затем депротеинизируют равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и далее равным объемом хлороформа. К водной фазе добавляют раствор 5 моль/л ацетата аммония до конечной концентрации 0,25 моль/л и 2 объема охлажденного до (-20°С) этилового спирта. Выпавший осадок ДНК собирают центрифугированием, промывают в 70%-ном растворе этанола, подсушивают при комнатной температуре до удаления остатков этанола и растворяют в 2 мл буфера ТЕ.

Измерение концентрации ДНК

Концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически при длине волны 256 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. 30 мкл раствора ДНК разводят буфером ТЕ до 3,0 мл, помещают в кювету спектрофотометра и определяют оптическую плотность раствора. В качестве контроля используют буфер ТЕ. Концентрацию полученного раствора ДНК (СДНК, мкг/мл) вычисляют по формуле:

 
     СДНК=АхЭхР, где
 

А - оптическая плотность раствора при длине волны 256 нм;

Э - 50 мкг/мл (при такой концентрации оптическая плотность раствора ДНК при 256 нм равна одной оптической единице);

Р - кратность разведения исследуемого раствора, в данном случае равная 100.

Пример расчета: в результате спектрофотометрического анализа раствора ДНК установлено, что оптическая плотность раствора при 256 нм составляет 0,2 оптических единиц. Тогда:

 
     СДНК=0,2х50х100=1000 мкг/мл (1 мг/мл)
 

Критерием чистоты препарата ДНК является соотношение значений оптической плотности раствора ДНК при длинах волн 256 и 280 нм. Для чистых препаратов ДНК указанное соотношение выше 1,7. Например, светопоглощение исследуемого разведенного раствора ДНК при 280 нм равно 0,11 оптической единицы. Тогда, соотношение 256/280 равно 0,20/0,11=1,81.

Полученный препарат очищенной клеточной ДНК в дальнейшем используют для приготовления меченой ДНК-зонда и построения калибровочного графика.

Получение меченой ДНК

В пробирку для микропроб вносят 2,0 МБк альфа(-32)Р-дезоксиаденозинтрифосфата (удельная радиоактивность 8-12х10(7) МБк/ммоль).

Затем пробирку помещают в ледяную баню и вносят следующие компоненты реакции: 5 мкл буфера для ник-трансляции, 1 мкг ДНК клеток штамма-продуцента, 1 мкл раствора дезоксицитидинтрифосфата, тимидинтрифосфата и дезоксигуанозинтрифосфата в концентрации 1 моль/л и деионизованную воду до 45 мкл. Раствор ДНК-азы 1 (1 мг/мл) разводят деионизованной водой в 10000 раз и 0,5 мкл полученного раствора вносят в реакционную смесь. Далее добавляют 15 ед. ДНК-полимеразы 1 Е. coli и смесь тщательно перемешивают. Реакционную смесь инкубируют в течение 2-х часов при температуре 15°С. Реакцию останавливают добавлением в реакционную смесь 2 мкл раствора ЭДТА концентрации 0,5 моль/л.

Определение удельной радиоактивности меченой ДНК

На 2 нитроцеллюлозных фильтра диаметром 2 см наносят по 1 мкл реакционной смеси. Один фильтр дважды отмывают в 20 мл холодного 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты в течение 5 мин, далее 2 мин в 10 мл этанола и высушивают при комнатной температуре. Оба фильтра помещают в сцинтилляционные флаконы для определения радиоактивности, наливают во флаконы по 4 мл толуолового сцинтилляционного раствора и определяют на счетчике количество импульсов в минуту. По полученным данным определяют процент включения метки, рассчитывают общую радиоактивность в 50 мкл реакционной смеси и, соответственно, удельную радиоактивность ДНК, т.е. количество импульсов в минуту на 1 мкг ДНК. Удельная радиоактивность ДНК должна быть не менее 2,0х10(8) имп/мин. Для реакции гибридизации необходимо взять (2+-0,5)х10(6) имп/мин на 1 мл гибридизационной смеси.

Очистка меченой ДНК

Предварительно готовят суспензию сефадекса G-25. Носик наконечника автоматической пипетки, вместимостью 1,0 мл, закрывают небольшим кусочком стекловаты и заполняют суспензией сефадекса. В полиэтиленовую центрифужную пробирку помещают пробирку для микропроб типа "Эппендорф", вместимостью 1,5 мл, а в нее наконечник пипетки с сефадексом. Пробирку центрифугируют при 18000 об/мин в течение 2,5 мин. Сефадекс в наконечнике еще раз промывают буфером ТЕ, содержащим 20 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Жидкость из эппендорфовской пробирки удаляют, в наконечник на гель наносят реакционную смесь с меченой ДНК и опять центрифугируют в том же режиме. Не включившиеся в ДНК меченые и немеченые нуклеозидтрифосфаты остаются в геле, меченая ДНК собирается на дне пробирки в объеме 50 мкл.

Иммобилизация ДНК на мембране

К полуфабрикату исследуемого препарата, объемом 0,5 мл, добавляют 1 мкл раствора ДНК спермы лосося концентрации 20 мг/мл, затем дважды проводят депротеинизацию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), собирают водный слой после центрифугирования в течение 5 мин при 5000 об/мин и осаждают двумя объемами этанола в присутствии ацетата аммония в конечной концентрации 0,3 моль/л. Пробы выдерживают 1 ч при температуре (- 20 °С) (можно оставить на ночь - 14-16 часов). Осажденные нуклеиновые кислоты собирают центрифугированием при 13000 об/мин в микроцентрифуге в течение 6 мин. Супернатант осторожно сливают, в пробирки с осадками нуклеиновых кислот добавляют 50 мкл 0,5 моль/л раствора гидроокиси натрия и выдерживают 20 мин при температуре 18-25°С. Пробы нейтрализуют на холоду равным объемом (50 мкл) нейтрализующего раствора и помещают в ледяную баню. Далее на нижнюю часть аппарата для дот-гибридизации кладут смоченную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, на нее помещают мембрану Hybond-N ("Амершам") и прижимают верхней частью аппарата, снабженной специальными зажимами. Верхняя часть аппарата для дот-гибридизации представляет собой пластину (132х100х18) с лунками. Исследуемые образцы вносят в лунки А (1-12) и в следующие ряды в зависимости от количества исследуемых проб.

Параллельно, рядом с исследуемыми образцами, наносят ряд известных разведений очищенной клеточной ДНК в концентрации от 20 нг до 0 пкг. Разведения готовят с помощью буфера ТЕ, содержащего ДНК-носитель (20 мкг/мл ДНК спермы лосося) следующим образом. В 8 пробирок для микропроб добавляют по 100 мкл буфера ТЕ, содержащего 20 мкг/мл ДНК носителя. Раствор ДНК штамма-продуцента разводят до концентрации 100 мкг/мл и 5 мкл этого раствора ДНК разводят до 500 мкл раствором ТЕ с 20 мкг/мл ДНК-носителя. Таким образом получают раствор с концентрацией 1000 нг/мл. 25 мкл этого раствора (25 нг) добавляют в первую пробирку, тщательно перемешивают, отбирают 25 мкл полученного раствора (5 нг) и переносят во вторую пробирку, тщательно перемешивают и отбирают 1/5 часть раствора (25 мкл содержащие 1 нг ДНК) и переносят в третью пробирку, тщательно перемешивают. Таким образом, разводят до восьмой пробирки. В восьмую пробирку ДНК не добавляют. В табл.1 представлены концентрации стандартного ряда ДНК в 1-8 пробирках.

Таблица 1

Концентрации стандартного ДНК в пробирках

 
------------------------T-----------------------------------------------¬
¦     N пробирки        ¦       Количество ДНК в пробирке               ¦
+-----------------------+-----------------------T-----------------------+
¦         1             ¦       20              ¦          нг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         2             ¦       4               ¦          нг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         3             ¦       0,8             ¦          нг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         4             ¦       160             ¦          пг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         5             ¦       32              ¦          пг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         6             ¦       6,4             ¦          пг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         7             ¦       1,28            ¦          пг           ¦
+-----------------------+-----------------------+-----------------------+
¦         8             ¦        0              ¦          пг           ¦
L-----------------------+-----------------------+-----------------------+
 

Содержимое каждой пробирки стандартного ряда ДНК обрабатывают равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 мин, собирают водный слой и осаждают двумя объемами этанола в присутствии 0,3 моль/л ацетата аммония. Пробы выдерживают 1 ч при (-20°С). Осажденные нуклеиновые кислоты собирают центрифугированием на микроцентрифуге при 13000 об/мин в течение 6 мин. Образцы стандартного ряда с известными концентрациями клеточной ДНК денатурируют аналогично пробам полуфабрикатов исследуемых препаратов, то есть добавляют в каждую пробирку 50 мкл раствора 0,5 моль/л гидроокиси натрия и инкубируют 20 мин при температуре 18-25°С. Далее нейтрализуют равным объемом нейтрализующего раствора и помещают на ледяную баню, затем наносят на мембрану через лунки. Аппарат для дот-гибридизации подключают к водоструйному насосу, чтобы растворы образцов полностью просочились через мембрану. Лунки промывают 200 мкл раствора 5х раствора SSC. Далее мембрану вынимают из аппарата, высушивают на фильтровальной бумаге при температуре 18-25°С. Для иммобилизации ДНК на мембране мембрану облучают ультрафиолетовым светом в течение 2-х мин или выдерживают 2 ч при 80°С.

Проведение реакции гибридизации

Мембрану с образцами ДНК помещают в полиэтиленовый пакет, запечатывают при помощи аппарата "Молния", оставляя небольшое отверстие для внесения в пакет растворов. Раствор для предгибридизации, подогретый до 42°С, вносят автоматической пипеткой в пакет из расчета 0,20 мл на 1 см мембраны. Выдавливают как можно больше воздуха из мембраны, запечатывают отверстие нагреванием, помещают пакет между двумя стеклами и помещают в водяную баню при 42°С на 2-3 часа. По истечении времени предгибридизации пакет вскрывают, отрезав один угол ножницами. Сливают раствор для предгибридизации как можно полнее и в пакет вносят раствор для гибридизации из расчета 0,10 мл на 1 см мембраны. Раствор для гибридизации это тот же раствор для предгибридизации, но содержащий меченую (альфа(-32)Р) ДНК. Меченую радиоактивным фосфором и очищенную ДНК (2,0х10(6) имп/мл раствора предгибридизации) перед добавлением в раствор для гибридизации прогревают при температуре 100°С 5 мин, с последующим быстрым охлаждением на ледяной бане. Из пакета удаляют воздух, запаивают отрезанный угол и инкубируют пакет с мембраной между стеклами в водяной бане при температуре 42°С в течение 24-х ч.

Отмывка мембраны

После окончания инкубации вынимают пакет из водяной бани, разрезают его вдоль 3-х сторон, вынимают мембрану и немедленно погружают в сосуд с раствором А при температуре 18-25°С. Через 5 мин переносят мембрану в другой сосуд, содержащий раствор Б и инкубируют в течение 15 мин при температуре 18-25°С, периодически помешивая. Затем переносят мембрану в сосуд с тем же раствором и инкубируют 2 часа при температуре 65°С, слегка покачивая. Меняют буфер на свежий и еще раз инкубируют 30 мин при температуре 18-25°С, периодически помешивая. Нельзя допускать высыхания мембраны ни на одном этапе промывания. После промывки мембрану высушивают на воздухе при температуре 18-25°С.

Радиоавтография

Сухую мембрану заворачивают в пленку типа "Saran wrap" ("Амершам", США) и помещают в кассету для рентгеновской пленки с усиливающим экраном Э4-В3А. Туда же помещают рентгеновскую пленку (ТУ 6-17-1245-83) типа РМ-В, кассету закрывают и экспонируют при температуре (-70°С) в течение 1-3 суток. Далее пленку проявляют погружением в раствор проявителя на 5-6 мин (в темноте). Затем пленку промывают холодной водопроводной водой и погружают в раствор фиксатора на 10 мин, после чего промывают холодной водой и высушивают.

Оценка результатов

На местах нанесения ряда известных разведений очищенных клеточных ДНК и на местах нанесения ДНК из образцов исследуемых препаратов (если она в них присутствует) на рентгеновской пленке появляются темные пятна. Количество примеси ДНК в образцах препаратов определяют визуально или при помощи денситометра путем сравнения интенсивности потемнения пятен в месте нанесения исследуемых проб с калибровочным рядом известных количеств клеточных ДНК.

В соответствии с требованиями ВОЗ и национальными руководящими документами количество примесей клеточных ДНК в биотехнологических препаратах должно быть менее 100 пкг на дозу. Для препаратов, предназначенных для многократного введения людям, содержание примеси клеточных ДНК должно быть менее 10 пкг на дозу.

Примечания.

I. Приготовление растворов.

1. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 8,0.

121,1 г трис(гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды, перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 8,0 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до1000 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4-6°С.

2. Буферный раствор трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 7,2.

121,1 г трис(гидроксиметил)аминометана помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят рН до 7.2 раствором НСl концентрации 1 моль/л. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4-6 °С.

3. Раствор динатриевой соли ЭДТА (трилон Б) концентрации 0,5 моль/л рН 8,0.

18,6 г ЭДТА динатриевой соли помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды, добавляют 45%-ный раствор гидроокиси натрия до полного растворения. Доводят рН до 8,045%-ным раствором гидроокиси натрия (NaOH). Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой, фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят в течение месяца при 4-6 °С.

4. Буферный раствор ТЕ.

1,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 8,0 вносят в градуированный химический стакан, прибавляют 0,2 мл буферного раствора трилона-Б концентрации 0,5 моль/л рН 8,0 и доводят деионизованной водой до 100,0 мл. Раствор хранят в течение месяца при 4-6°С.

5. 10%-ный раствор SDS.

50,0 г додецилсульфата натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 300,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 500,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 18-25°С.

6. Раствор ацетата аммония концентрации 5 моль/л.

38,5 г ацетата аммония помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой и фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят при 4-6°С.

7. Раствор водонасыщенного фенола.

100,0 мл расплавленного фенола наливают в емкость и прибавляют 100,0 мл буферного раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 8,0. Содержимое емкости перемешивают стеклянной палочкой. Раствор хранят при 4-6°С в течение 1-2-х мес.

8. Раствор РНК-азы 1.

0,01 г РНК-азы 1 помещают в пробирку для микропроб и растворяют в 1,0 мл деионизованной воды. Раствор хранят при (- 20 °С).

9. Раствор NaOH концентрации 5 моль/л.

20,0 г гидроокиси натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 18-25°С.

10. Раствор MgCl2 концентрации 1 моль/л.

20,0 г магния хлористого шестиводного помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Плотность раствора р=1,075. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B. Раствор хранят при 4-6°С в течение 1-2-х мес.

11. Раствор ДНК-азы 1.

0,001 г ДНК-азы 1 помещают в пробирку для микропроб и растворяют в 0,1мл 10%-ного раствора SDS, прибавляют 0.4 мл деионизованной воды и 0,5 мл глицерина. Содержимое пробирки перемешивают и хранят при (-20°С).

12. Раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов концентрации 0,001 моль/л.

2,9 мг дезоксиаденозинтрифосфата,3,1 тимидинтрифосфата и 3,0 мг дезоксигуанидинтрифосфата помещают в пробирку и растворяют в 5,0 мл деионизованной воды. Раствор разливают по 0,5 мл в пробирки для микропроб и хранят при (-20°С) в течение шести месяцев.

13. Буферный раствор для ник-трансляции.

1,5 мг бычьего сывороточного альбумина (БСА) помещают в пробирку, прибавляют 5,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 7,2, 1,0 мл раствора MgCl2 концентрации 1 моль/л и доводят раствор до 10 мл деионизованной водой. Раствор хранят в течение 6-ти месяцев при (-20°С).

14. Приготовление сефадекса G-25.

В химический стакан наливают 80,0 мл раствора ТЕ и медленно прибавляют 5,0 г сефадекса G-25. Оставляют на ночь при 18-25°С. Хранят суспензию при 4°С.

15. 20х раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым) концентрации 3 моль/л.

173,0 г натрия хлористого и 88,2 г лимоннокислого натрия помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 700,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B.

Хранят раствор при 18-25°С в течение 2-х месяцев.

16,5х раствор SSC (лимоннокислый натрий с натрием хлористым) концентрации 0,6 моль/л.

5,0 мл 20х раствора SSC вносят в градуированный химический стакан и доводят объем до 20,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 1825°С в течение недели.

17. Нейтрализующий раствор.

0,87 г хлорида натрия помещают в градуированную мерную пробирку, прибавляют 5,0 мл раствора трис-HCl концентрации 1 моль/л рН 8,0 и прибавляют 0,42 мл концентрированной НСl. Доводят объем до 10 мл деионизованной водой, фильтруют через стеклянный фильтр GF/B и хранят при 18-25°С в течение месяца.

18. Очистка формамида.

5,0 г смешанной катионанионионообменной смолы помещают в градуированный химический стакан и заливают 50,0 мл формамида, перемешивают магнитной мешалкой 30-40 мин при 18-25°С. Чистый формамид отделяют от смолы через-стекловолокнистый фильтр GF/B. Хранят раствор при (-20°С).

19. Раствор денатурированной спермы лосося.

400,0 мг ДНК спермы лосося помещают в емкость, прибавляют 20,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Затем кипятят раствор ДНК в течение 10 мин на водяной бане, разливают по 1,0 мл в пробирки для микропроб и хранят при (-20°С) в течение 2-х месяцев.

20. Раствор Денхарда 100х.

1,0 г фикола, 1,0 г поливинилпиролидона, 1,0 г БСА помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 30,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 50,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют через стеклянный фильтр GF/B и хранят при (-20°С) в течение 2-х месяцев.

21. Раствор для предгибридизации.

В градуированный химический стакан вносят 25,0 мл раствора формамида, 0,75 мл раствора денатурированной ДНК спермы лосося, 2,5 мл 10%-ного раствора SDS, 12,5 мл 20х раствора SSC, 2,5 мл 100х раствора Денхарда и доводят объем до 50,0 мл деионизованной водой. Раствор фильтруют и хранят при (-20°С) в течение месяца.

22. Раствор для гибридизации.

Это тот же раствор для предгибридизации, но содержащий меченую альфа(-32)Р ДНК. Меченную радиоактивным фосфором и очищенную ДНК (2,0х10(6) имп/мл) перед добавлением в раствор для гибридизации прогревают при 100°С 5 мин и быстро охлаждают на ледяной бане. Раствор готовят перед использованием.

23. Раствор для отмывки мембраны.

Раствор А (2х раствор SSC с 0,5%-ным раствором SDS).

В градуированный химический стакан помещают 50,0 мл 20х раствора SSC, 25,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до 500,0 мл деионизованной водой. Раствор готовят перед использованием.

Раствор Б (0,2х раствор SSC с 0,1%-ным раствором SDS).

В градуированный химический стакан помещают 5,0 мл 20х раствора SSC, 10,0 мл 10%-ного раствора SDS и доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Раствор готовят перед использованием.

24. Раствор проявителя.

К 700,0 мл деионизованной воды (температура воды 60°С), 2,2 г метола, 8,8 г гидрохинона, 72,0 г безводного сульфита натрия, 48,0 г карбоната натрия и 4,0 г бромистого калия по очереди помещают в градуированный химический стакан и по очереди растворяют. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой. Хранят раствор при 18-25°С в темной посуде.

25. Раствор фиксатора.

160,0 г тиосульфата натрия, 40,0 г хлористого аммония помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 730,0 мл деионизованной воды (температура воды 60°С) и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 1000,0 мл деионизованной водой и хранят при 18-25°С в темной посуде.

26. 10%-ный раствор ТХУ.

10,0 г трихлоруксусной кислоты помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 70,0 мл деионизованной воды и перемешивают до полного растворения. Доводят объем до 100,0 мл деионизованной водой. Раствор хранят при 4-6°С.

27. Сцинтилляционный раствор.

4,0 г РРО (2,5-дифенилоксазола), 0,2 г РОРОР (1,4-ди(2-(5-фенилоксазолил) бензина) помещают в градуированный химический стакан, прибавляют 730,0 мл толуола, перемешивают до полного растворения стеклянной палочкой. Доводят объем до 1000,0 мл толуолом. Хранят раствор при 18-25°С в темной посуде.

При отборе проб используют автоматические пипетки с соответствующими диапазонами объемов:

от 1 мкл до 10 мкл:

от 5 мкл до 40 мкл;

от 40 мкл до 200 мкл;

от 200 мкл до 1000 мкл;

от 1 мл до 5 мл.

7. Испытание на стерильность

Испытание на стерильность проводят с применением "Сухой питательной среды для контроля стерильности (тиогликолевой)" отечественного производства. Возможен выпуск варианта среды без тиогликолята натрия в составе сухого вещества. В этом случае тиогликолят натрия или тиогликолевую кислоту добавляют ex tempore. Вместо коммерческой тиогликолевой среды может быть использована тиогликолевая среда индивидуального приготовления.

Контроль стерильности МИБП проводят путем поэтапного исследования образцов готового препарата в полуфабрикате и готовой серии препарата.

Готовым препаратом в полуфабрикате считают препарат, находящийся в одной производственной емкости (или разлитый в бутылки из этой емкости), из которой производят розлив в ампулы или флаконы.

Примечание.

Контроль полуфабриката на более ранних стадиях должен осуществляться в соответствии с технологическими регламентами.

7.1. Правила отбора образцов препарата для испытания
на стерильность

Образец для контроля - это количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду по представленной ниже схеме (не менее 2 мл). В том случае, если емкости (ампулы или флаконы) содержат меньший объем препарата, то образец составляют из смеси содержимого нескольких емкостей.

7.1.1. Отбор образцов готового препарата в полуфабрикате

Объем выемки готового препарата в полуфабрикате для испытания на стерильность должен быть достаточным, чтобы обеспечить достоверность результатов контроля, но не менее 10 мл. Перед отбором выемки содержимое производственной емкости, в которой находится полуфабрикат, тщательно перемешивают. Взятая проба должна быть посеяна в виде 5-ти или более образцов по схеме 7.4 и с учетом антимикробного действия п. 7.2.

7.1.2. Отбор образцов препарата в процессе розлива

В процессе розлива препарата для испытания на стерильность берут не менее, чем по одному образцу в начале, середине и в конце розлива. Для контроля могут быть взяты пробы, отобранные в процессе розлива в отдельные лабораторные емкости (пробирки, флаконы) или герметизированные емкости, в которые осуществляется розлив препарата.

Примечание.

При розливе препаратов, которые в дальнейшем подвергаются лиофильному высушиванию, необходимо оставлять до окончания контроля стерильности высушенной продукции утроенное количество образцов (не менее 9-ти) разлитого жидкого препарата в герметизированном виде. Эти образцы могут быть исследованы в случае пророста образцов высушенного препарата для выяснения причин контаминации.

7.1.3. Отбор образцов готового препарата

При контроле стерильности готового (разлитого, высушенного) препарата количество контролируемых емкостей (ампул или флаконов) определяется с учетом общего количества емкостей в серии. Для определения минимального числа емкостей, необходимого для контроля стерильности, следует произвести расчет по формуле:

     n=0,4 кв.кореньN, где

n - необходимое для контроля число емкостей, не менее 10-ти и не более 40;

N - число емкостей в серии.

Принимая во внимание, что за образец для контроля принято количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду (не менее 2 мл), число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов может не совпадать. В случаях, когда объем препарата в каждой емкости равен или превышает 2 мл, число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов будет одинаковым или количество образцов будет превышать число емкостей, взятых для испытания. При меньшем объеме розлива (менее 2 мл в емкости) число засеваемых образцов будет меньше, чем число контролируемых емкостей за счет объединения нескольких емкостей в один образец.

Для удобства расчетов предлагаются таблицы 1 и 2, позволяющие определить число емкостей и образцов, необходимое для испытания на стерильность с учетом объема серии и количества препарата в каждой емкости.

Примечания.

1. Число емкостей, необходимое для контроля стерильности на предприятии, представляет собой суммарное число емкостей, контролируемых на разных этапах - не менее n/2 в производственном отделении и не менее n/2 в ОБК.

2. Если серия включает в себя менее 500 емкостей, количество контролируемых емкостей должно быть не менее 10-ти.

3. При необходимости, с учетом особенностей технологического изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие надежность контроля стерильности препарата.

4. При отбраковке разлитого препарата из-за несоответствия физических свойств требованиям НТД (помутнение, появление хлопьев), отбракованные ампулы или флаконы должны быть переданы в ОБК для выяснения характера помутнений и, при необходимости, проведения контроля стерильности.

Количество емкостей, отправленное в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, должно соответствовать общему количеству, контролируемому в производственном отделе и в ОБК, с учетом величины серии и объема препарата, разлитого в ампулы или флаконы.

7.2. Определение антимикробного действия МИБП

Во избежание неправильной оценки испытания на стерильность необходимо определить для каждого наименования МИБП (в том числе и для их полуфабрикатов), обладает ли он антимикробным действием.

Для этого в каждые две пробирки с 20 мл тиогликолевой среды вносят по 1,0 мл исследуемого препарата и добавляют по 0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест-штамма в разведении 1000 клеток/мл. Содержимое пробирок осторожно перемешивают до равномерного распределения препарата в питательной среде. Посевы со штаммами для определения антимикробного действия инкубируют при температуре от 30 до 35°С в течение 48 часов, а для определения антигрибкового действия от 20 до 25°С в течение 72-х часов. В контрольные образцы вместо исследуемого препарата вносят аналогичное количество физиологического раствора и соответствующие тест-штаммы.

Для проверки антимикробного действия МИБП используют тест-микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538 Р; Bacillus subtilis. АТСС 6633; Escherichia coli АТСС 25922, а для противогрибкового действия - Candida albicans АТСС 885-653.

При отсутствии антимикробного действия МИБП в опытных и контрольных пробирках должен наблюдаться рост перечисленных тест-микроорганизмов в указанные сроки. При наличии антимикробного действия возможно торможение роста одного или нескольких тест-штаммов, при сохранении их роста в контрольных образцах.

При выявлении антимикробного действия препарат разводят, изменяя соотношение объемов посевного материала и питательной среды. Первоначально увеличивают объем питательной среды до 250 мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие МИБП, уменьшают объем посевного материала до 0,5 мл в каждой из 2-х пробирок (флаконов). Экспериментально установленное соотношение объемов питательной среды и посевного материала, обеспечивающее нейтрализацию антимикробного действия препарата, должно соблюдаться при испытании его на стерильность методом прямого посева.

В случае неэффективности разведения МИБП используют метод мембранной фильтрации.

7.3. Техника проведения контроля стерильности

Перед внесением в бокс ампулы (флаконы) с препаратами должны быть проверены на герметичность путем тщательного просмотра, а препараты, высушенные под вакуумом, должны быть проверены на вакуум. После этого ампулы (флаконы) обрабатывают методом погружения в 3%-ный раствор перекиси водорода не менее, чем на 2 мин.

Лица, проводящие контроль стерильности, непосредственно перед работой в боксе тщательно моют руки с мылом при помощи щетки. В предбокснике обувь меняют на специальную боксовую, надевают стерильный халат, колпак или косынку и 4-х слойную марлевую повязку (маску), которая должна закрывать нос и рот. При работе в боксе движения, разговоры, перемещения должны быть максимально ограничены.

В начале и в конце посева образцов каждой серии проводится обработка рук 70° спиртом, а поверхности рабочего стола 96° спиртом с последующим прожиганием (при посеве, насчитывающем более 30 емкостей одной серии, подобная обработка проводится также и в середине посева этой серии).

Перед вскрытием ампул или флаконов оттянутый конец ампулы или горлышко флакона смачивают 96° спиртом и обжигают в пламени горелки.

Исследуемый препарат набирают стерильной пипеткой при помощи ножной или ручной груши, предварительно автоклавированной. Перед забором препарата пустая пипетка проводится через пламя горелки, но не прокаливается. Посев каждого образца препарата производят отдельной стерильной пипеткой на внутреннюю стенку пробирки у раздела сред (необходимо избегать вдувания воздуха в питательную среду). Использованные пипетки, ампулы и флаконы от препаратов помещают в 3%-ный раствор перекиси водорода и оставляют на 24 часа, после чего производится их дальнейшая обработка.

Примечания.

1. Запрещается прокаливать ампулы и пастеровские пипетки в пламени горелки.

2. Запрещается производить посев пипеткой без груши (ртом).

Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или флаконов необходимо встряхивать (т.к. микробы-контаминанты могут осесть на дно).

Образцы сухих препаратов предварительно растворяют тиогликолевой средой или стерильным растворителем (изотонический раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т.п.) в объеме, предусмотренном технической документацией, и после растворения засевают на питательную среду. Стерильность используемого растворителя проверяют путем его посева (по 1 мл) на 2 пробирки, содержащие по 20 мл тиогликолевой среды. Пробирки выдерживают при температуре 30-35°С и 20-22°С соответственно 14 сут. одновременно с опытными пробирками. Посев растворителя для контроля стерильности производят до начала работы и после ее окончания. Если при посеве сухих препаратов используют несколько флаконов растворителя, стерильность каждого должна быть проверена аналогичным способом.

Примечание.

Растворение препаратов тиогликолевой средой не используют для метода мембранной фильтрации.

7.4. Схема контроля стерильности

7.4.1. Метод прямого посева

Контролируемый на стерильность образец засевают пипеткой по 1 мл на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, одну из которых инкубируют при температуре от 30 до 35°С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре от 20 до 25°С для выявления грибов и бактерий с оптимумом роста в данном температурном режиме. Продолжительность инкубации посевов составляет не менее 14 сут. В течение всего срока проводится их периодический просмотр.

Для препаратов, вызывающих помутнение питательной среды (препараты, содержащие сорбенты, микробную массу, мозговую ткань и т.п.), посев производят по указанной выше схеме, но на 5-7 сутки из каждой пробирки производят пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие по 10,0 мл тиогликолевой среды. Все пробирки выдерживают после пересева при соответствующих температурах до окончания инкубации (14 сут.) со дня первичного посева.

Примечание.

При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные экспериментально-обоснованные требования в отношении срока и режима инкубации.

Таблица 2

Количество испытуемого препарата, необходимое для посева,
в зависимости от объема содержимого емкостей, составляющих серию

 
-------------T-------------------------------T--------------------------¬
¦Объем содер-¦   Минимальный объем           ¦  Минимальный объем       ¦
¦жимого одной¦   препарата, взятый для посева¦  тиогликолевой среды для ¦
¦емкости (мл)¦   из каждой емкости (мл)      ¦  каждой температуры      ¦
+------------+-------------------------------+--------------------------+
¦Менее 2     ¦ Весь объем, объединения ем-   ¦В 10 раз больше объема    ¦
¦            ¦ кости до 2                    ¦препарата, взятого для по-¦
¦2-24        ¦          2                    ¦сева из каждой емкости    ¦
¦25-100      ¦          6                    ¦                          ¦
¦более 100   ¦          10                   ¦                          ¦
L------------+-------------------------------+---------------------------
 

7.4.2. Метод мембранной фильтрации

При определении стерильности МИБП, обладающих выраженным антимикробным действием и МИБП, разлитых в емкости более 100 мл, используют метод мембранной фильтрации.

Аппаратура

В работе используют любую, подходящую для этих целей фильтрационную систему, состоящую из закрытого резервуара и приемника, между которыми помещают закрепленную надлежащим образом мембрану, а также насоса, обеспечивающего фильтрацию жидкости.

Фильтрационные системы делятся на два типа: в одних, мембрану после завершения процедуры фильтрации асептически извлекают, делят пополам и погружают в две емкости со 100 мл тиогликолевой среды для последующей инкубации при температурах от 30 до 35°С и от 20 до 25°С (тип 1); в других - мембраны закреплены в двух резервуарах, куда после фильтрации помещают по 100 мл тиогликолевой среды, для последующей инкубации в этих же емкостях при соответствующих температурах (тип II). Установки второго типа могут быть многоразового использования (их стерилизуют в собранном виде, вместе с мембраной, насыщенным паром при избыточном давлении 0,11+-0,02 МПа/(1,1+-0,2) кгс/см2 и температуре (121+-1)°С в течение 18-20 мин) или одноразовые стерильные системы (например, стеритесты фирмы Millipore для Steritest Compact System). Используют мембраны с размером пор 0,47 мкм, диаметром 47 мм, скорость прохождения потока 55-75 мл/мин, при давлении 93,3 кПа (70 см рт.ст.).

Примечание.

При содержании в МИБП масел фильтр стерилизуют отдельно, тщательно просушивают и с соблюдением асептики помещают в фильтродержатель или используют одноразовые стеритесты.

Методика испытания

Используют то количество емкостей или то количество готового препарата в полуфабрикате, которые требуются для проведения испытания стерильности (п.7.1.1. и п.7.1.3). Если содержимое емкости более 2 мл, но менее 500 мл - фильтруется весь объем препарата. Для емкостей более 500 мл фильтруют только 500 мл из всего объема.

Фильтрование отобранных образцов проводят в асептических условиях. Фильтрационную систему целесообразно устанавливать в настольных ламинальных боксах. Обработку препаратов перед внесением в бокс проводят в соответствии с п.7.3.

Испытуемый препарат растворяют, если это необходимо, соответствующим растворителем или 0,9%-ным раствором натрия хлорида, а затем объединяют, либо непосредственно в резервуаре для установок 1 типа, либо в отдельной стерильной емкости, с последующим разделением объема препарата на две половины для фильтрации в 2-х резервуарах для установок II типа. Если емкости больших объемов, то фильтрацию можно проводить без предварительного объединения, разделив их содержимое приблизительно поровну между двумя резервуарами, если не предусмотрено автоматического разделения, как, например, в установке Steritest Compact System ("Millipore"). Для препаратов, представляющих собой вязкую жидкость или суспензию, не поддающихся быстрой фильтрации, используют разведение достаточным количеством жидкости 1 для увеличения скорости фильтрации. При фильтрации препаратов, обладающих антимикробным действием, в конце процедуры фильтр промывают 3 порциями по 100 мл жидкости 1. Если препарат содержит лецитин или масла, вместо жидкости 1 используют жидкость 2 (приложение).

Для контроля стерильности условий, в которых проводятся испытания, необходимо фильтровать растворитель без испытуемого МИБП, с последующим воспроизведением всех вышеописанных операций.

Тиогликолевую среду с помещенными в нее фильтрами выдерживают при температурах от 30 до 35°С и от 20 до 25°С в течение 7 сут. при ежедневном осмотре.

7.5. Учет результатов контроля стерильности

Посевы периодически просматривают в рассеянном свете и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов оценивается визуально по выявлению мутности, осадка, хлопьев и других микроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов необходимо подтвердить микроскопированием мазков окрашенных по Граму. В протоколах испытания отмечается: при какой температуре выявлен рост, его характер, морфологические признаки обнаруженных микроорганизмов, окраска по Граму.

Испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность при отсутствии роста микроорганизмов во всех образцах. При обнаружении роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на стерильность на том же количестве образцов, что и в первый раз. При отсутствии роста микроорганизмов при повторном посеве испытуемый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность. В случае роста микроорганизмов при повторном посеве, морфологически сходных с выявленными при первичном посеве, испытуемый препарат считают нестерильным.

Для готового препарата в полуфабрикате допускается только одно повторное испытание на стерильность. В случае обнаружения роста при испытании на стерильность готового препарата в полуфабрикате при повторении теста, независимо от характера микрофлоры, его бракуют.

Для готового препарата возможно проведение испытания на стерильность в третий раз на удвоенном количестве образцов, если в первый и во второй раз выявлен рост различных по морфологии микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизмов после инкубации в третьем испытании готовый препарат считают удовлетворяющим требованиям испытания на стерильность. При наличии роста хотя бы в одной пробирке (колбе, флаконе) испытуемый препарат считают нестерильным.

Результаты контроля исследуемых препаратов регистрируются в специальных производственных журналах.

7.6. Требования, предъявляемые к боксам

Испытание на стерильность МИБП должно проводиться квалифицированным персоналом в специальных, предназначенных только для данного вида работ, боксах с обеспечением строгих правил асептики.

Боксы представляют собой изолированные застекленные камеры достаточной площади и кубатуры для проведения в них бактериологических исследований. Боксы должны быть хорошо освещены и обеспечены вентиляцией. Оптимальным является оборудование боксов приточно-вытяжной вентиляцией с подачей стерильного кондиционированного воздуха и с преобладанием притока (не менее 1,27 мм водн.ст.). Скорость потока воздуха - 20 объемов в час.

Внутреннее устройство боксов должно обеспечивать легкость и надежность поддержания чистоты и возможность дезинфекционной обработки. С этой целью газовые и водопроводные трубы, а также электропроводку размещают вне бокса или в толще его стен. Отопительные батареи устанавливают гладкими без ребер, что препятствует осаждению пыли. Стены бокса на высоту не менее полутора метров от пола облицовывают метлахской плиткой, или, как и потолок, окрашивают в светлые тона масляной краской. Полы покрывают линолеумом, метлахской плиткой или пластиком. Такая отделка поверхностей позволяет использовать при уборке помещения дезинфицирующие растворы. В боксе должно находиться минимальное количество мебели - стол и табуреты. Запрещается размещение в боксах и предбоксниках водопроводных кранов и раковин, так как они являются источником грибковой микрофлоры.

Работу рекомендуется проводить в настольных ламинарных боксах с подачей стерильного воздуха в рабочую зону, что позволяет проводить исследования в условиях, исключающих возможность загрязнения испытуемого препарата.

Примечание.

В боксах, предназначенных для проведения контроля стерильности МИБП, работа с живыми микробными культурами не допускается.

К боксу должен прилегать предбоксник, отделенный от него стеклянной перегородкой с дверью и передаточными окнами - помещение, куда вносятся подготовленные для посевов препараты, питательные среды, пипетки и биксы со стерильной одеждой для работы. В предбокснике персонал переодевается в стерильную одежду и специальную обувь для боксов.

К предбокснику должна примыкать комната, где хранятся питательные среды, необходимые для работы, стерильная посуда. В этой комнате проводят всю вспомогательную работу (деконтаминация емкостей с МИБП, штативов для питательных сред, маркировка пробирок и т.п.).

Ежедневно бокс и предбоксник подвергаются тщательной уборке и деконтаминации путем протирания ветошью, смоченной в 3%-ной перекиси водорода с 0,5% сульфанола или порошка "Лотос". При приготовлении раствора воду добавляют в пергидроль, а затем моющее средство. Этот раствор используют после приготовления.

Для приготовления 10 л раствора берут следующие количества препаратов: 1200 мл пергидроля, 50 г моющего средства и 8750 мл воды при температуре от 40 до 50°С. Для простоты приготовления используют вымеренную по объему ингредиентов посуду. Норма расхода дезинфицирующего раствора 70-100 мл/м2.

Готовят раствор и обрабатывают бокс и предбоксник с соблюдением правил техники безопасности при работе с агрессивными веществами.

При отсутствии возможности использовать дезинфицирующий раствор, производят обработку горячим (50-60°С) мыльносодовым раствором (1% раствора соды или стирального порошка и 0,5% нашатырного спирта) с последующим протиранием стен, полов, мебели одним из следующих дезинфицирующих растворов:

- 2%-ный раствор хлорамина;

- 3%-ный раствор фенола;

- раствор антисептола.

Для приготовления антисептола берут 2 раствора: 50%-ный раствор хлорной извести и 5%-ный раствор кальцинированной соды. Перед употреблением растворы сливают в равных объемах и разбавляют в 50 раз водой. Работу с антисептолом производят в резиновых перчатках.

Для обеззараживания боксов и предбоксников применяют бактерицидные лампы БУВ, установленные из расчета: 1 лампа БУВ-30 на 12 м3 объема воздуха или 2-2,5 ватта мощности на м2 поверхности (числа в названиях ламп обозначают их мощность в ваттах). Лампы размещают на потолках или стенах на уровне 1,5 м от пола. Облучение бокса производят до начала работы в течение 1,5-2 ч. Во время работы лампы должны быть выключены. Необходимо учитывать время эксплуатации ламп и, по окончании гарантийного срока, заменять лампы новыми, если даже они продолжают "светить".

В боксах, оборудованных принудительной вентиляцией и ламинарными настольными боксами работа должна начинаться не ранее, чем через 30 мин после их включения. Это минимальное время, необходимое для замены воздуха стерильным, удаления пыли поднявшимся потоком воздуха и установления стационарного потока воздуха.

Ежедневно в начале и в конце работы контролируют бактериальную чистоту воздуха в боксе и в предбокснике, используя метод седиментации. Для этого чашки Петри с питательным агаром и средой Сабуро помещают открытыми на 15 мин в нескольких точках (например, рабочий стол, ламинарный бокс и вблизи вентиляции). Затем, выдерживают в термостате 48 ч - чашки с питательным агаром при температуре от 30 до 35°С и 72 ч чашки со средой Сабуро при температуре от 20 до 25°С. При появлении роста колоний делают мазки, окрашенные по Граму, микроскопируют их и отмечают характер микрофлоры в специальных журналах.

Допустимым считается рост не более 3-х колоний микробов сапрофитов на одной чашке. Рост большего числа колоний указывает на повышенную бактериальную загрязненность воздуха в боксе. В этих случаях необходимо произвести дополнительную дезинфицирующую уборку бокса и предбоксника, а также проанализировать случай увеличения бактериальной контаминации и наметить мероприятия по ее устранению. В случаях появления колоний грибов, помимо дезинфекции обращают особое внимание на снижение влажности в боксе и предбокснике путем просушивания их электронагревательными приборами. При проявлении спорообразующих микроорганизмов, а также грибов, при уборке помещения увеличивают концентрацию перекиси водорода до 6%.

У лиц, работающих в боксе, периодически проверяют степень бактериальной обсемененности рук после мытья. Эту проверку проводят следующим образом: пальцами рук прикасаются к поверхности плотной питательной среды в чашке Петри и делают несколько круговых движений, "засеянные" чашки помещаются в термостат при температуре 30-35°С на 48 ч для питательного агара и при температуре 20-25°С на 72 ч для среды Сабуро. Появление более 3-х колоний на одной чашке Петри указывает на недостаточную чистоту рук для проведения асептической работы.

Результаты проверки контаминации воздуха бокса и предбоксника, бактериальной обсемененности рук работников должны быть зафиксированы в специальных журналах.

Постоянно следует обращать внимание на надежность стерилизации используемых для работы инструментов, лабораторной посуды, дистиллированной воды и различных растворов. Должен быть налажен надежный контроль указанных материалов, а также тщательный контроль стерильности используемых питательных сред.

Приложение

 
     Жидкость 1
     пептона ферментативного            1 г
     воды дистиллированной              до 1000 мл
     рН после стерилизации              7,1+-0,2
 
     Жидкость 2
     пептона ферментативного            5 г
     твина-80                           10 г
     воды дистиллированной              до 1000 мл
     рН после стерилизации              7,1+-0,2
 

Жидкости разливают в колбы или флаконы по 100 мл и стерилизуют так же как питательные среды.

Таблица 3

Количество емкостей для контроля стерильности в зависимости
от общего числа емкостей в серии и объема препарата
в каждой емкости

 
----------------------T-------------------------------------------------¬
¦ Кол-во емкостей в   ¦             Объем препарата в емкости           ¦
¦ серии               +------------------------T------------------------+
¦                     ¦   0,5 мл               ¦      1-1,5 мл          ¦
¦                     +------------------------+------------------------+
¦                     ¦ Кол-во контролируе-    ¦Кол-во контролируе-     ¦
¦                     ¦ мого препарата         ¦мого препарата          ¦
¦                     +--------T-------T-------+-------T-------T--------+
¦                     ¦ всего  ¦пр-во  ¦ОБК    ¦всего  ¦пр-во  ¦ОБК     ¦
¦                     +----T---+---T---+---T---+---T---+---T---+---T----+
¦                     ¦ об-¦ем-¦об-¦ем-¦об-¦ем-¦об-¦ем-¦об-¦ем-¦об-¦ем- ¦
¦                     ¦ ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦ра-¦ко- ¦
¦                     ¦ зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦зц-¦ст- ¦
¦                     ¦ ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦ов ¦ей  ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦   501-1000          ¦  4 ¦ 16¦ 2 ¦ 8 ¦ 2 ¦ 8 ¦ 6 ¦ 12¦ 3 ¦ 6 ¦ 3 ¦ 6  ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  1001-2000          ¦  6 ¦ 24¦ 3 ¦ 12¦ 3 ¦ 12¦ 8 ¦ 16¦ 4 ¦ 8 ¦ 4 ¦ 8  ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  2001-3000          ¦  6 ¦ 24¦ 3 ¦ 12¦ 3 ¦ 12¦ 10¦ 20¦ 5 ¦ 10¦ 5 ¦ 10 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  3001-4000          ¦  6 ¦ 24¦ 3 ¦ 12¦ 3 ¦ 12¦ 12¦ 24¦ 6 ¦ 12¦ 6 ¦ 12 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  4001-5000          ¦  8 ¦ 32¦ 4 ¦ 16¦ 4 ¦ 16¦ 14¦ 28¦ 7 ¦ 14¦ 7 ¦ 14 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  5001-6000          ¦  8 ¦ 32¦ 4 ¦ 16¦ 4 ¦ 16¦ 16¦ 32¦ 8 ¦ 16¦ 8 ¦ 16 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  6001-7000          ¦  8 ¦ 32¦ 4 ¦ 16¦ 4 ¦ 16¦ 16¦ 32¦ 8 ¦ 16¦ 8 ¦ 16 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  7001-8000          ¦ 10 ¦ 40¦ 5 ¦ 20¦ 5 ¦ 20¦ 18¦ 36¦ 9 ¦ 18¦ 9 ¦ 18 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  8001-9000          ¦ 10 ¦ 40¦ 5 ¦ 20¦ 5 ¦ 20¦ 20¦ 40¦ 10¦ 20¦ 10¦ 20 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+----+
¦  9001-10000         ¦ 10 ¦ 40¦ 5 ¦ 20¦ 5 ¦ 20¦ 20¦ 40¦ 10¦ 20¦ 10¦ 20 ¦
¦  и более            ¦    ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦    ¦
L---------------------+----+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+-----
----------------------T------------------------¬
¦ Кол-во емкостей в   ¦Объем препарата в емко- ¦
¦ серии               ¦сти                     ¦
¦                     +------------------------+
¦                     ¦2,0 мл и более          ¦
¦                     +------------------------+
¦                     ¦ Кол-во контролируе-    ¦
¦                     ¦ мого препарата         ¦
¦                     +--------T-------T-------+
¦                     ¦ всего  ¦пр-во  ¦ОБК    ¦
¦                     +----T---+---T---+---T---+
¦                     ¦ об-¦ем-¦об-¦ем-¦об-¦ем-¦
¦                     ¦ ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦ра-¦ко-¦
¦                     ¦ зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦зц-¦ст-¦
¦                     ¦ ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦ов ¦ей ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦   501-1000          ¦ 12 ¦ 12¦ 6 ¦ 6 ¦ 6 ¦ 6 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  1001-2000          ¦ 18 ¦ 18¦ 9 ¦ 9 ¦ 9 ¦ 9 ¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  2001-3000          ¦ 22 ¦ 22¦ 11¦ 11¦ 11¦ 11¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  3001-4000          ¦ 26 ¦ 26¦ 13¦ 13¦ 13¦ 13¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  4001-5000          ¦ 28 ¦ 28¦ 14¦ 14¦ 14¦ 14¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  5001-6000          ¦ 32 ¦ 32¦ 16¦ 16¦ 16¦ 16¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  6001-7000          ¦ 34 ¦ 34¦ 17¦ 17¦ 17¦ 17¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  7001-8000          ¦ 36 ¦ 36¦ 18¦ 18¦ 18¦ 18¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  8001-9000          ¦ 38 ¦ 38¦ 19¦ 19¦ 19¦ 19¦
+---------------------+----+---+---+---+---+---+
¦  9001-10000         ¦ 40 ¦ 40¦ 20¦ 20¦ 20¦ 20¦
¦  и более            ¦    ¦   ¦   ¦   ¦   ¦   ¦
L---------------------+----+---+---+---+---+----
 

7.7. Требования к качеству тиогликолевой среды

7.7.1. Готовая к употреблению тиогликолевая среда должна отвечать следующим требованиям:

7.7.1.1. Стерильность. Должна быть стерильной.

7.7.1.2. Ростовые свойства. Питательная среда должна обеспечивать рост аэробного и анаэробного тест-штаммов при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток.

7.7.1.3. Нейтрализующие свойства. Питательная среда должна нейтрализовать действие мертиолята в концентрации 0,5х10(-5) г/мл среды.

При контроле препаратов, не содержащих ртутный консервант (мертиолят), проверку нейтрализующих свойств можно не осуществлять. В этом случае тиогликолевая среда должна быть использована в течение 2-х недель со дня приготовления.

Для препаратов с ртутным консервантом среду используют не позднее 3-х суток. Конкретные сроки годности - сутки, двое или трое суток - устанавливают при "входном" контроле новой серии среды путем определения ее нейтрализующих свойств после хранения приготовленной среды в течение одних, двух и трех суток.

Готовую к употреблению тиогликолевую среду следует хранить в защищенном от света месте при температуре 18-25°С.

7.7.2. Контроль качества тиогликолевой среды

7.7.2.1. Определение стерильности. Пробирки или другие емкости со средой после ее стерилизации, в количестве не менее 2% от партии, помещают в термостат при температуре (37+-1)°С. Учет результатов проводят через 46-50 ч путем визуального просмотра всех пробирок со средой. В случае обнаружения пророста (помутнение среды) бракуют всю партию.

Образцы среды, выдержанные при температуре (37+-1)°С, для испытания препаратов на стерильность не используют.

7.7.2.2. Определение ростовых свойств. Для определения ростовых свойств тиогликолевой среды используют следующие тест-штаммы:

- Alcaligenes faecalis 415;

- Clostridium novyi 198.

Alcaligenes faecalis 415. Получен из института Листера (г.Лондон) в 1946 г. Грамотрицательная палочка. Строгий аэроб. Непатогенен для человека и животных.

Clostridium novyi 198. Выделен в 1930 г. Крупная грамположительная спорообразующая палочка. Споры овальной формы, расположены субтерминально. Строгий анаэроб. Непатогенен для морских свинок и мышей.

Тест-штаммы получают из ГИСК им.Л.А.Тарасевича с соответствующим паспортом. Замена указанных тест-штаммов другими не допускается.

7.7.2.2.1. Хранение и подготовка тест-штаммов для контроля качества тиогликолевой среды.

Alcaligenes faecatis 415.

Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 0,5 мл) бульон Хоттингера (приложение п.2), тщательно перемешивают до получения гомогенной суспензии и переносят в пробирку с бульоном Хоттингера и со скошенным агаром Хоттингера (приложение п.3). Посевы инкубируют в течение 20-24 ч при температуре (37+-1)°С.

Выросшую на скошенном агаре Хоттингера культуру пересевают в 2-3 пробирки с той же средой (агар Хоттингера*(1)). Посевы инкубируют в течение 20-24 ч при температуре (37+-1)°С, после чего полученную культуру "уколом" пересевают в 8-10 пробирок со средой Романова (приложение п.4). Через 20-24 ч инкубации посевов при температуре (37+-1) °С ватные пробки пробирок с культурой накрывают полиэтиленовой пленкой (для предотвращения высыхания). Пробирки с культурой хранят при температуре 2-8°С (6-8 месяцев). Допускается, в случае необходимости (получение дополнительной партии пробирок с культурой, закладываемых на хранение), произвести пересев тест-штамма A. faecalis 415 со среды Романова на агар Хоттингера и вновь на среду Романова. Большее количество пассажей культуры не допускается.

Для получения рабочей культуры тест-штамм A. faecalis 415 со среды Романова пересевают в 2-3 пробирки со скошенным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют в течение 20-24 ч при температуре (37+-1)°С, затем вновь пересевают в 2-3 пробирки с агаром Хоттингера и, после выращивания в течение 18-24 ч при температуре (37+-1)°С, используют для оценки ростовых и нейтрализующих свойств тиогликолевой среды.

Clostridium novyi 198.

Вскрывают ампулу с лиофилизированной культурой, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 1 мл) предварительно регенерированную*(2) среду Тароцци (приложение п.5), тщательно перемешивают*(3). Полученную гомогенную суспензию переносят в 2 пробирки со средой Тароцци (посевной материал вносят в нижнюю часть пробирки). Посевы инкубируют в течение 44-48 ч при температуре (37+-1)°С.

Культуру из обеих пробирок, соблюдая правила асептики, переносят во флакон, вместимостью 20-30 мл, (кусочки мяса не должны попадать) и центрифугируют при частоте вращения 3000 об/мин в течение 20 мин. Затем с помощью пипетки отсасывают надосадочную жидкость, а к полученной биомассе добавляют небольшое количество стерильного раствора для разведения культуры - разводящей жидкости (приложение п.6), перемешивают, переносят в пробирку и готовят микробную взвесь, соответствующую 10-ти единицам по стандартному образцу мутности (ОСО 42-28-59-85).

По 1 мл полученной взвеси высевают*(4) в 10-15 пробирок с 10 мл предварительно регенерированной*(5) питательной среды для получения культуры в споровой форме (приложение п.7). Посевы инкубируют в течение 44-48 ч при температуре (37+-1)°С, после чего содержимое пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки, делают мазки культуры (окрашивание производят 1%-ным раствором генцианвиолета в течение 30 с), микроскопируют и определяют количество спор (М) в процентах по формуле:

           n
     М = ----- х 100%, где
           N
 

n - число спор в 3-5 полях зрения;

N - общее число (не менее 100) сосчитанных клеток (палочки и споры) в 3-5 полях зрения.

Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4

< < Обновление, архив