Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2 "Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года
Страница 1
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6
В целях совершенствования системы обеспечения иммунологической безопасности переливания крови и ее компонентов, профилактики посттрансфузионных реакций и осложнений приказываю:
1. Ввести в действие с 01.02.98:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови (приложение 1).
2. Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения группы крови системы АВО (приложение 2).
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток (приложение 3).
4. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения группы крови системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ) (приложение 4).
5. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус (приложение 5).
6. Инструкцию по удалению из сывороток антирезус антител другой специфичности (приложение 6).
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови (приложение 7).
8. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели (приложение 8).
9. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (антитела моноклональные анти-D) (приложение 9).
10. Инструкцию по применению анти-D IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности (цоликлона анти-D супер) (приложение 10).
11. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител (приложение 11).
12. Инструкцию по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека (приложение 12).
13. Инструкцию по применению цоликлона анти-С моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер) (приложение 13).
14. Инструкцию по применению цоликлона анти-Е оноклонального для определения антигена Е системы резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-Е супер) (приложение 14).
15. Инструкцию по предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных факторами Кеll и с(hr') (приложение 15).
16. Инструкцию по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус (приложение 16).
17. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов (приложение 17).
18. Инструкцию по определению иммунных антител групповой системы АВО (приложение 18).
19. Инструкцию по изготовлению стандартных эритроцитов и их применению в изосерологических исследованиях (приложение 19).
2. Руководителям органов управления здравоохранением субъектов Российской Федерации обеспечить неукоснительное применение утвержденных инструкций.
3. Управлению организации медицинской помощи населению, Управлению охраны здоровья матери и ребенка обеспечить контроль за своевременным внедрением в практику и качеством проведения иммуносерологических исследований.
4. Считать недействующими на территории Российской Федерации:
1. Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови, утвержденную Минздравом СССР 05.12.90 N 05-14/37-14.
2. Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/26.
3. Инструкцию по определению группы крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток: утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/27.
4. Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/28.
5. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус антител другой специфичности", утвержденную Минздравом СССР 27.11.90 N 10-11/136.
6. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/29.
7. Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели, утвержденную Минздравом СССР 06.12.90 N 05-14/38-14.
8. Инструкцию по применению цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы Резус (антитела моноклональные анти-D), утвержденную Минздравом СССР 21.08.90.
9. Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител, утвержденную Минздравом СССР 07.09.90 N 05-14/30.
10. Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека, утвержденную Минздравом СССР 26.03.79 N 06-14/3.
11. Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденную Минздравом СССР 27.11.90 N 10-11/138.
12. Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов, утвержденную Минздравом СССР 14.10.76 N 06-14/1.
13. Методические рекомендации "Определение иммунных антител групповой системы АВО", утвержденные Минздравом СССР 27.11.90 N 10-11/135.
5. Считать утратившими силу:
1. Инструкцию по применению цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
2. Инструкцию по применению анти-Rh0(D) IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности крови человека (цоликлона анти-D супер), утвержденную Минздравмедпромом России 14.07.94.
3. Инструкцию по применению цоликлона анти-rh'(С) моноклонального для определения антигена С системы Резус на эритроцитах человека (цоликлон анти-С супер), утвержденную Минздравмедпромом России 17.03.95.
4. Методические рекомендации "Способ выявления иммунных анти-А, анти-В антител в сыворотке крови человека", утвержденную Минздравом РСФСР 15.09.89.
6. Контроль за исполнением настоящего приказа возложить на заместителя Министра Стародубова В.И.
Министр
Т.Б. Дмитриева
Приложение 1
Инструкция
по предупреждению несовместимости при переливании крови
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
I. Введение
1. Общие сведения
Основным принципом предупреждения гемотрансфузионных осложнений является обеспечение совместимости крови донора и реципиента.
Прежде чем приступить к переливанию крови, врач должен предусмотреть, чтобы кровь доноров была совместима с кровью реципиента.
Под совместимостью понимается благоприятное сочетание крови донора и реципиента. Биологически невозможное их сочетание по антигенам и антителам различных групповых систем определяет несовместимость крови донора и реципиента.
В настоящее время известно более 11 групповых систем крови человека, но значение их в переливании крови неравноценно. В первую очередь совместимость при переливании крови должна быть обеспечена правильным выбором донора по группам крови системы АВО и резус-антигену D.
2. Группы крови АВО
Наибольшее значение для обеспечения совместимости при переливании крови имеет выбор крови по системе АВО.
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов, называемых агглютиногенами, и антител по отношению к ним - агглютининов, находящихся в плазме крови людей.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В и два групповых агглютинина - aльфа и бета. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови:
-----------------T----------------T----------------T--------------------¬ ¦ ¦Агглютиногены ¦ Антитела ¦ Частота ¦ ¦Обозначение ¦в эритроцитах ¦ в плазме ¦ встречаемости ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ в процентах ¦ +----------------+----------------+----------------+--------------------+ ¦ О-альфа бета(I)¦ нет ¦ анти-А(альфа) ¦ 33,5 ¦ ¦ ¦ ¦ анти-В(бета) ¦ ¦ +----------------+----------------+----------------+--------------------+ ¦ А-бета(II) ¦ А ¦ анти-В(бета) ¦ 37,8 ¦ +----------------+----------------+----------------+--------------------+ ¦ В-альфа(III) ¦ В ¦ анти-А(альфа) ¦ 20,6 ¦ +----------------+----------------+----------------+--------------------+ ¦ АВо(IV) ¦ А,В ¦ нет ¦ 8,1 ¦ L----------------+----------------+----------------+---------------------
Агглютинин альфа (альфа) является антителом по отношению к агглютиногену А, а агллютинин бета (бета) является антителом по отношению к агглютиногену В. Ошибочное переливание иногруппной крови, содержащей агглютиногены, против которых у больного имеются антитела, т.е. крови, содержащей агглютиноген А, при наличии у реципиента агллютининов альфа (анти-А), или крови, содержащей агглютиноген В, при наличии у реципиента агглютинина бета (анти-В), приводит к явлению несовместимости.
3. Система Резус (Rh-Нr)
Кроме антигенов системы АВО, в эритроцитах людей имеется множество других антигенов, образующих различные групповые системы, независимые как от системы АВО, так и друг от друга.
Наиболее важное значение при переливании крови, после групп крови
w
АВО, имеют антигены системы резус D, С, Е, с, е, С , особенно,
обладающий наибольшей активностью, антиген D, называемый резус-фактором.
Эти антигены, находясь в эритроцитах людей в различных сочетаниях, образуют 28 фенотипов (см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови").
Так же как и антиген D, любой другой фактор этой системы может вызвать образование изоиммунных антител у лиц, его не имеющих, однако значительно реже и, большей частью, лишь как сопутствующих антителам против антигена D.
Главным отличием системы резус от системы АВО является то, что в крови людей содержатся только агглютиногены этой системы, а антител по отношению к ним, подобных антителам альфа и бета системы АВО, обычно, в норме у людей не имеется.
Однако, у резус-отрицательных лиц при некоторых условиях (при переливании или при другом способе введения резус-положительной крови, или во время беременности женщины резус-положительным плодом) может произойти сенсибилизация, т. е. могут образоваться изоиммунные антитела антирезус.
Последствием этой сенсибилизации у беременной женщины является рождение детей с гемолитической болезнью или внутриутробная смерть плода. Поэтому наличие у женщин такого анамнеза, так же как сведения о трансфузионных реакциях, как у женщин, так и у мужчин, уже указывают на возможное наличие у них резус-антител.
Если больному, в крови которого имеются резус-антитела, ошибочно перелить резус-положительную кровь, то это приведет к явлению несовместимости.
Лиц, в крови которых содержится резус-антиген D, т.е. резус-положительных (Rh+), около 85%.
15% людей являются резус-отрицательными (rh-). (Вычислено среди лиц русской национальности).
4. Значение других групповых систем эритроцитов при переливании крови
Антигены других групповых систем также обладают активностью, в
у
первую очередь Келл (К), Даффи (F ), Кидд (Jk), затем антигены системы
МNSs и другие.
Однако, антигенная активность их значительно ниже и антитела по отношению к ним встречаются редко.
Антитела ко всем этим антигенам могут образоваться у человека любой группы системы АВО, а также, кроме антител анти-D, независимо от резус-принадлежности, т.е. как у резус-отрицательных, так и у резус-положительных лиц. Образуются они при тех же условиях, что и антитела анти-D, т.е. при повторном введении крови и беременностях, и могут служить причиной заболевания новорожденного или трансфузионного осложнения.
5. Причины несовместимости и меры ее предупреждения
Если реципиенту, в крови которого имеются антитела, перелить кровь донора, эритроциты которого содержат антигены, против которых направлены эти антитела, такая кровь будет разрушаться в организме реципиента, т.е. она является для него несовместимой.
Перед переливанием крови врач должен убедиться в том, что предназначенная для переливания кровь не содержит антигенов, против которых в крови больного имеются антитела, т.е. совместима с кровью реципиента.
Для того, чтобы не допустить переливания несовместимой крови и следующих за этим клинических проявлений несовместимости, врач, переливающий кровь, обязан:
- правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО;
- правильно выбрать кровь в отношении резус - принадлежности;
- проверить всю относящуюся к этому документацию;
- произвести контрольные исследования, включающие пробы на совместимость.
Врач должен также учесть, что кроме нормально существующих антител системы АВО - альфа и бета и имеющих большое практическое значение изоиммунных антител антирезус-D, у реципиента, хотя и значительно реже, могут встретиться антитела к другим антигенам эритроцитов: С, Е, с, е, w у С , К, F , Jk, М, N, S, s и др.
Предупреждению несовместимости по отношению к этим антигенам, так же как и в отношении антигена D должно, в первую очередь, служить тщательное выявление трансфузионного и акушерского анамнеза. Кроме того, несовместимость к некоторым из них может быть установлена при проведении проб на совместимость.
6. Выбор крови, совместимой в отношении групп крови АВО (см. рис.1)
Вопросы совместимости в отношении групп системы АВО решаются различно в зависимости от того, переливается ли цельная кровь или предполагается использовать эритроциты, освобожденные от плазмы (отмытые, размороженные).
а) при переливании цельной крови она должна быть одноименной по группам АВО, т.е. реципиенту может переливаться кровь той же группы, к которой принадлежит он сам. При переливании цельной крови детям это правило является обязательным.
При переливании крови взрослым реципиентам в исключительных случаях допускается переливание крови группы О(I) реципиентам другой группы, однако количество переливаемой крови в этих случаях должно быть ограничено.
Эти ограничения связаны с тем, что групповые антитела у доноров группы O(I), особенно агглютинины альфа (анти-А), иногда носят иммунный характер, бывают очень активными и поэтому могут вызывать разрушение эритроцитов крови реципиента другой группы;
б) при использовании эритроцитов, освобожденных от плазмы (отмытых, размороженных), эритроциты группы О(I) являются как бы универсальной трансфузионной средой и могут быть перелиты реципиенту любой группы. Реципиенты группы АВ(IV), в крови которых не содержится групповых антител, являются как бы универсальными реципиентами и им могут быть перелиты эритроциты любой группы крови, освобожденные от плазмы.
Кровь
одноименной Оальфа бета(I) Aбета(II) Вальфа(III) ABo(IV)
совместимой LT-------------+---------+------T-----L--------
группы ¦ ¦ ¦ ¦
---------------T---------T-----------T-------¬
Реципиент ¦Оальфа бета(I)¦Aбета(II)¦Вальфа(III)¦ABo(IV)¦
L--------------+---------+-----------+--------
Кровь
неодноименной --------------¬---------¬------------¬--------¬
группы Оальфа бета(I) Aбета(II) Вальфа(III) ABo(IV)
но совместимой
группы
(переливается в
исключительных
случаях)
Рисунок 1. Схема совместимости по группам системы АВО при переливании цельной крови.
7. Выбор крови, совместимой в отношении резус-антигена D
Кроме групп системы АВО, при переливании крови должна учитываться резус-принадлежность донора и реципиента. Переливаемая кровь должна быть одноименной с кровью реципиента в отношении резус-принадлежности.
Это особенно важно для резус-отрицательных реципиентов, независимо от наличия или отсутствия у них резус-антител, в последнем случае для предупреждения возможного их образования.
При переливании эритроцитов, освобожденных от плазмы, резус-положительным новорожденным с гемолитической болезнью, рекомендуется введение резус-отрицательных эритроцитов.
8. Проверка документации
Выбрав кровь для переливания больному, специалист обязан:
а) сравнить запись определения группы крови реципиента по системе АВО (в истории болезни) и донора (на контейнере с кровью, приготовленной для переливания) и убедиться, что, согласно этим записям, кровь донора совместима с кровью реципиента в отношении групп крови системы АВО;
б) проверить запись о резус-принадлежности в истории болезни реципиента и на контейнере с кровью и убедиться, что кровь донора и реципиента совпадают по резус-принадлежности.
После проверки документации необходимо сделать контрольные исследования.
9. Контрольные исследования
Независимо от проведенных исследований и имеющихся записей, непосредственно перед тем, как приступить к переливанию крови, специалист обязан:
а) определить групповую принадлежность крови больного и сверить результат с записью в истории болезни и с обозначением группы крови донора на контейнере (флаконе):
б) определить групповую принадлежность крови донора, взятой из флакона (из трубочки контейнера), и сверить результат с записью на нем;
в) произвести пробу на совместимость по группам крови АВО (см. Раздел I и III);
г) произвести пробу на совместимость по резус-антигену D (см. разделы I, IV, V, VI).
II. Общие сведения о пробах на совместимость переливаемой крови
1. Порядок исследования
Пробы на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D проводятся отдельно и не могут заменить друг друга, так как антитела разного характера требуют разных методов для своего выявления.
Для проб на совместимость используется сыворотка крови реципиента и консервированная кровь или эритроцитная масса донора.
Если больному переливается кровь из нескольких флаконов (контейнеров), пробы на совместимость должны быть сделаны с кровью из каждого флакона (контейнера), даже если на них обозначено, что кровь получена от одного и того же донора.
Сыворотка больного должна быть свежей, полученной в тот же день, когда делается переливание крови, или накануне при условии сохранения ее при температуре 4-8°С. Исключением являются сроки взятия сыворотки для проведения пробы на совместимость у больных с гемотрансфузионными осложнениями (см. раздел VII, п.9).
2. Получение сыворотки больного и крови донора
Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови без стабилизатора в пробирку, на которой надписывают фамилию и инициалы реципиента, группу его крови и дату. При этом врач должен лично убедиться в том, что надписи на пробирке сделаны правильно и относятся к тому больному, у которого взята эта кровь.
Через 1-2 минуты пробирку с кровью сильно встряхивают для отделения свертка от стенок пробирки или обводят его сухой стеклянной палочкой.
После ретракции свертка от него отделяется сыворотка, которая и служит для пробы на совместимость*(1).
Кровь донора получают из контейнера, который подготовлен для переливания. Для этого кровь выпускают через иглу в небольшом количестве (5-10 капель) в пробирку или на пластинку, на которой будет производиться проба. На пробирке (пластинке) надписывают фамилию, инициалы донора, группу его крови и номер контейнера. При этом врач должен лично убедиться в том, что на пробирке (пластинке) правильно написаны все сведения о доноре, имеющиеся на контейнере, из которого получена эта кровь.
3. Характеристика антител системы АВО и условия проведения пробы на
совместимость по группам крови АВО
Антитела системы АВО - альфа и бета - являются врожденными у человека. Они представляют собой агглютинины, вызывающие склеивание несовместимых эритроцитов в прямой реакции между сывороткой и эритроцитами. Эта реакция хорошо протекает на плоскости при температуре около 20° и поэтому при этих же условиях производится проба на совместимость по группам крови АВО.
4. Характеристика резус-антител
В отличие от нормальных естественных антител системы АВО антитела антирезус, так же как и другие аллоиммунные антитела, не являются врожденными, а появляются в крови у человека лишь вследствие изоиммунизации и отличаются от антител системы АВО, в частности, тем, что требуют других условий для своего выявления.
Антиэритроцитарные антитела бывают разной формы: полные и неполные. Полные антитела активны при проведении реакции в солевой среде при температуре 37°; неполные проявляют свое действие в других условиях, которыми являются: проведение реакции в нативной сыворотке с подогревом, добавление различных коллоидов или других реактивов.
5. Способы выявления резус-антител и выбор методики для проведения
пробы на совместимость по резус-антигену D
Ввиду того, что при сенсибилизации к резус-антигену D в подавляющем большинстве случаев образуются неполные антитела, а полные антитела образуются редко и почти всегда вместе с неполными, в лечебной практике обычно используются для пробы на совместимость те реакции, которые выявляют именно неполные антитела. Такими пробами являются:
а) проба с применением полиглюкина (раздел IV);
б) проба с применением желатина (раздел V);
в) непрямая проба Кумбса (раздел VI);
г) проба на плоскости при температуре 48°С (раздел VII).
Все перечисленные пробы выявляют неполные резус-антитела и поэтому в лечебной практике для определения совместимости можно пользоваться любой из них, однако наиболее чувствительными являются непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина.
Кроме резус-антител эти пробы выявляют и многие неполные изоиммунные антитела другой специфичности. Поэтому непрямая проба Кумбса и проба с применением желатина особенно рекомендуются как проба на совместимость при переливании крови больным, перенесшим трансфузионную реакцию, и другим сенсибилизированным лицам, чувствительным к введению чужих эритроцитов, хотя и совместимых по группе крови системы АВО и по резус-принадлежности*(2).
III. Проба на совместимость по группам крови системы АВО
Проба на совместимость по группам крови АВО производится в течение 5 минут, на плоскости, при комнатной температуре.
Техника
Для исследования следует использовать белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью. На пластинке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного, фамилию, инициалы и группу крови донора и номер контейнера с кровью.
На пластинку накапать 2 - 3 капли сыворотки больного и туда же добавить маленькую каплю крови донора так, чтобы соотношение крови и сыворотки было приблизительно 1:10 (для удобства рекомендуется сначала спустить через иглу несколько капель крови донора на борт пластинки, а затем оттуда концом сухой стеклянной палочки перенести маленькую каплю крови для перемешивания с сывороткой больного).
Кровь размешать с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 5 минут.
Оценка результата
Если в смеси сыворотки больного и крови донора наступила агглютинация эритроцитов - агглютинаты видны сначала в виде мелких, затем крупных комочков на фоне полностью или почти полностью обесцвеченной сыворотки - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если смесь крови донора и сыворотки больного по истечении 5 минут остается гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации, то это означает, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении групп крови системы АВО.
Кровь донора с кровью реципиента несовместима
Кровь донора с кровью реципиента совместима
Рисунок 1. Оценка результата пробы на совместимость по группам АВО.
Следует помнить, что при несовместимости по группам крови АВО агглютинация наступает обычно в течение первой минуты, но при низком титре антител у больного, а также при слабо выраженной активности агглютиногена у донора (например, подгруппа А2), агглютинация может наступить значительно позже, иногда только к концу 5-й минуты.
При некоторых патологических состояниях, например при ожогах, циррозах печени, при септико-пиемических состояниях, сыворотка больных приобретает свойство вызывать неспецифическое склеивание эритроцитов в так называемые монетные столбики, симулирующие агглютинацию, поэтому выбор совместимой крови таким больным бывает затруднен.
В этих случаях следует вновь проверить групповую принадлежность крови донора и больного и, если в этом отношении не было ошибки и кровь выбрана правильно, проверить результат пробы на совместимость микроскопически при подогревании и добавлении изотонического раствора NаСl. Для этого снова произвести пробу и, если при микроскопии видны не агглютинаты из эритроцитов, а "монетные столбики", и при последующем добавлении 2-3 капель изотонического раствора NаСl и подогревании до 37°С они расходятся и эритроциты располагаются в виде гомогенной взвеси - можно считать кровь донора совместимой в отношении групп крови системы АВО.
После того, как установлена совместимость по группам крови системы АВО, врач должен убедиться, что кровь донора совместима с кровью больного также в отношении резус-антигена D, для чего произвести еще одну из проб на совместимость: пробу с 33%-ным раствором полиглюкина (раздел IV), пробу с применением желатина (раздел V) или непрямую пробу Кумбса (раздел VI), пробу на плоскости при температуре +48°С (раздел VII).
IV. Проба на совместимость с применением 33% раствора полиглюкина
Проба проводится в пробирке без подогрева в течение 5 минут. Для пробы применяется 33%-ный раствор полиглюкина, приготовленный специально для лабораторных целей.
Техника
Для исследования использовать центрифужную или любую другую пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы, группу крови больного и донора, номер контейнера с кровью.
На дно пробирки пастеровской пипеткой внести 2 капли сыворотки больного, одну каплю донорской крови, одну каплю 33% раствора полиглюкина и перемешать содержимое путем встряхивания.
Пробирку наклонить почти до горизонтального положения, затем медленно поворачивать таким образом, чтобы содержимое ее растекалось по стенкам. Такое растекание содержимого пробирки по стенкам делает реакцию более выраженной.
Контакт эритроцитов с сывороткой больного при поворачивании пробирки следует продолжать не менее 3 минут. Через 3-5 мин. в пробирку долить 2-3 мл изотонического раствора NaCl и перемешать содержимое путем 2-3-х-кратного перевертывания пробирки. (Не взбалтывать!)
Оценка результата.
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов в виде взвеси мелких или крупных комочков иногда хлопьевидной формы на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости, это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в нем не наблюдается признаков агглютинации эритроцитов, это значит, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-антигена D.
Кровь донора несовместима с кровью реципиента
Кровь донора совместима с кровью реципиента
Рисунок 2. Оценка результата пробы на совместимость с применением 33% раствора полиглюкина.
V. Проба на совместимость с применением 10% раствора желатина
Проба производится в пробирке при температуре 46-48°С в течение 10-15 минут.
Техника
Для исследования использовать центрифужную или любую другую пробирку емкостью не менее 10 мл.
На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного и донора, и номер контейнера с кровью.*(3)
На дно пробирки при помощи пипетки поместить одну маленькую каплю эритроцитов донора, затем туда накапать две капли подогретого до разжижения 10% раствора желатина и 1-2 капли сыворотки больного. Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед употреблением. При помутнении или появлении хлопьев желатин непригоден.
Содержимое пробирки перемешать путем встряхивания и поместить ее в водяную баню или в горизонтальном положении в термостат при 46-48°С на 15 мин.
После инкубации долить в нее 5-8 мл изотонического раствора NаСl, содержимое пробирки перемешать 1-2-кратным перевертыванием ее и просмотреть на свет невооруженным глазом и затем путем микроскопирования.
Оценка результата
Если в пробирке наблюдается агглютинация эритроцитов - эритроциты видны в виде взвеси мелких, реже крупных комочков на фоне просветленной или полностью обесцвеченной жидкости - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если содержимое пробирки остается равномерно окрашенным и в нем не наблюдается каких-либо признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с кровью реципиента (см.рис.3).
Кровь донора и реципиента несовместима
Кровь донора и реципиента совместима
Рисунок 3. Оценка результата пробы на совместимость по резус - фактору с применением 10 % раствора желатина.
VI. Непрямая проба Кумбса, как проба на совместимость переливаемой крови
Непрямая проба Кумбса, как проба на совместимость переливаемой крови, производится путем инкубации сыворотки больного с эритроцитами донора в течение 45 минут при 37°С с последующим отмыванием их, добавлением специального реактива (сыворотки для пробы Кумбса) и наблюдением в течение 20 мин*(4).
Техника
Пробирку с кровью донора долить до верха изотоническим раствором NаСl и перемешать содержимое путем перевертывания пробирки. Пробирку центрифугировать около 5 мин. до оседания эритроцитов, после чего отсосать надстой жидкости и снова повторить процедуру отмывания эритроцитов.
На другой центрифужной или любой небольшой пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови больного и донора и номер флакона с кровью. На дно этой пробирки при помощи пастеровской пипетки перенести из первой пробирки одну маленькую каплю (0,05 мл) отмытых эритроцитов донора и добавить к ним 3 капли сыворотки больного.
Сыворотку перемешать с эритроцитами встряхиванием пробирки, после чего поставить ее в термостат при 37°С на 45 минут.
Через 45 минут пробирку вынуть из термостата, долить в нее до верха изотонический раствор NаСl, перемешать содержимое и центрифугировать до осаждения эритроцитов. Такое отмывание произвести 2 раза, а если используется видалевская или еще меньшая пробирка - 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая отмывную жидкость.
К отмытым, плотно осевшим эритроцитам добавить 4-6 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5% взвеси эритроцитов.
Одну каплю 5% взвеси эритроцитов перенести на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью, добавить туда 1-2 капли сыворотки для пробы Кумбса и перемешать капли стеклянной палочкой.
Пластинку слегка покачать, затем на 1-2 минуты оставить в покое и снова периодически покачивать, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут. *(5)
Оценка результата
Если добавление сыворотки для пробы Кумбса вызовет агглютинацию эритроцитов - агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне - это значит, что кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
Если взвесь эритроцитов осталась гомогенно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что кровь донора совместима с кровью больного в отношении резус-антигена D, а также в отношении других изоантигенов, к которым могли образоваться изоиммунные антитела неполной формы.
В районах, где до настоящего времени использовалась только проба на совместимость на чашке Петри, временно допускается сохранение этой пробы в период перехода на пробы с применением 10% раствора желатина или 33% раствора полиглюкина или использования непрямой пробы Кумбса.
VII. Меры предупреждения несовместимости по отношению
к другим антигенам системы резус и антигенам других серологических
систем. Подбор крови для изосенсибилизированных больных
1. Общие сведения
Выше было сказано, что, кроме антигенов системы АВО и резус-антигена D, причиной несовместимости при переливании крови могут быть другие антигены системы резус или антигены других систем. Это может произойти в тех случаях, когда кровь переливается сенсибилизированному больному, имеющему в крови антитела против этих антигенов.
Для решения вопроса о возможной сенсибилизации больного к различным антигенам первостепенное значение имеет трансфузионный и акушерский анамнез. Наличие в анамнезе указаний на возможную сенсибилизацию (см.п.4) требует дальнейшего исследования крови реципиента (см.п.5) и, если будут найдены антитела, специального выбора или индивидуального подбора крови (см.п.п.6, 7). Следует отметить, что многие изоиммунные антитела выявляются теми же методами, что и антитела анти-D, некоторые - так же как антитела системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора в отношении этих антител может быть выявлена уже при выполнении проб на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D.
2. Значение пробы на совместимость по группам крови АВО
для выявления других антител
В некоторых случаях в крови у людей образуются изоиммунные антитела анти-М и анти-N. Эти антитела в большинстве случаев активны в тех же условиях, что и антитела системы АВО, т.е. вызывают агглютинацию эритроцитов на плоскости при комнатной температуре. Поэтому, если у больного имеются антитела анти-М или анти-N, а эритроциты донора содержат эти факторы, то несовместимость по отношению к ним выявится при пробе на совместимость по группам крови АВО. Кровь такого донора не должна быть перелита этому реципиенту.
В таких случаях кровь реципиента необходимо исследовать в лаборатории на изоиммунные антитела. Предварительно следует проверить правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения результатов исследования специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами крови донора.
3. Значение проб на совместимость по резус-антигену
для выявления других антител
При проведении проб на совместимость по резус-антигену D можно выявить также неполные изоиммунные антитела к другим антигенам системы резус: С, Е, с, е, а иногда и к антигенам других систем эритроцитов. С этой точки зрения наиболее чувствительными являются непрямая проба Кумбса и проба с желатином, при помощи которых выявляются неполные антитела ко всем антигенам системы Резус, системам Келл-Челлано, Даффи, Кидд и некоторым другим. Следовательно, если в крови реципиента имеются такие антитела, то проба Кумбса и проба с желатином выявит несовместимость крови донора, в которой содержатся эти антигены. Кровь такого донора де должна быть перелита этому реципиенту.
Для уточнения специфичности антител и выбора совместимого донора кровь реципиента необходимо исследовать в специализированных лабораториях. Предварительно следует проверить правильность определения группы крови и резус-принадлежности. Если состояние больного не позволяет отложить трансфузию до получения результатов исследования специфичности антител, следует попытаться найти совместимую кровь путем проведения проб на совместимость с несколькими образцами крови доноров.
4. Учет трансфузионного и акушерского анамнеза
Если больной получал трансфузии крови, одноименной или совместимой по группам крови системы АВО и резус-принадлежности D, но несмотря на это, трансфузии сопровождались реакциями или осложнениями, это указывает на возможную сенсибилизацию больного к другим антигенам системы резус или к антигенам других систем и на несовместимость для него крови, содержащей эти антигены.
Если женщина имела беременности, закончившиеся рождением детей с гемолитической болезнью или рождением мертвых плодов, и кровь этой женщины резус-положительная или резус-отрицательная, но не содержит антител анти-D, то это также указывает на возможную сенcибилизацию женщины к какому-либо другому антигену системы резус или других систем и на несовместимость для нее крови, содержащей эти антигены.
В таких случаях кровь реципиента должна быть заблаговременно исследована на наличие изоиммунных антител.
5. Исследование крови на наличие изоиммунных антител
Определение изоиммунных антител производится специалистами - серологами в учреждениях службы крови (отделениях, станциях переливания крови), располагающих стандартными эритроцитами различной фенотипической структуры. Для этой цели удобно пользоваться эритроцитами группы О(I). Среди них должны быть образцы эритроцитов резус-отрицательные и резус-положительные различного фенотипа: СсDЕе, СсDее, ССDее, ссDЕе, ссDЕЕ, ссDее, Ссddее, ссddЕе.
Среди резус-положительных эритроцитов целесообразно иметь образцы гомозиготные и гетерозиготные по антигенам С и Е, т.е. содержащие и не содержащие антигены с и е.
Среди резус-отрицательных эритроцитов следует иметь образцы различные по антигенам системы Даффи, Келл-Челлано, Кидд. Кроме того, все стандарты должны быть типированы по системе МNSs, Рр, Левис и др.
Ввиду того, что изоиммунные антитела могут быть как полной, так и неполной формы, их следует выявлять, используя разные методы при различных температурных режимах. Для выявления неполных антител необходимо проводить непрямую пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (желатин, полиглюкин). Для выявления полных антител проводят реакцию солевой агглютинации при разных температурах: 37°, 20°, 4°С.
Заключение о наличии, а также о форме и специфичности антител делают по результатам реакции во всех методах.
Форма антител. Если положительная реакция выявилась с различными образцами эритроцитов только при проведении непрямой пробы Кумбса (или реакции с применением желатина или полиглюкина), это значит, что в исследованной сыворотке содержатся только неполные антитела.
Если положительная реакция выявилась при непрямой пробе Кумбса (или в реакции с применением желатина или полиглюкина) и одновременно в реакции солевой агглютинации, это значит, что в сыворотке содержатся как неполные, так и полные антитела. Полные антитела могут быть тепловыми, тогда положительный результат выявится при температуре 37°С или холодовыми, давшими положительный результат при 20°С или 4°С.
Если сыворотка дала положительный результат только в реакции солевой агглютинации в пробирках, это значит, что она содержит только полные антитела - тепловые или холодовые (в зависимости от того, при какой температуре выявилась агглютинация).
Если агглютинация эритроцитов не наблюдается ни в одной из этих проб, это говорит об отсутствии как полных, так и неполных изоиммунных антител к антигенам, содержащимся в стандартных эритроцитах, которые были использованы при этом исследовании.
Специфичность антител устанавливается в зависимости от результатов реакции со стандартными эритроцитами, содержащими разные антигены. Это заключение необходимо сделать для полных и неполных антител в отдельности.
Большую роль при определении специфичности антител может сыграть определение антигенной структуры эритроцитов самого больного. Если такое исследование было возможным, то это очень облегчит решение вопроса о специфичности антител, так как у больного могут быть антитела только к тем антигенам, которые не содержатся в его собственной крови.
Неполные антитела в одной и той же сыворотке могут иметь как одну, так и различную специфичность.
При одновременном присутствии в сыворотке неполных и полных антител они также могут быть одной или различной специфичности.
Полные антитела большей частью бывают моноспецифичными.
Таким образом, исследование сыворотки больного с применением разных методов при наличии стандартных эритроцитов, типированных по различным изоантигенам, позволяет решить вопрос о характере иммунизации.
Если у больного выявлены изоиммунные антитела, то, зная их специфичность, можно обеспечить совместимость при переливании крови специальным выбором донора (см. п.6).
Если у больного выявлены антитела, но определить их специфичность невозможно, например, из-за недостаточного набора стандартных эритроцитов, совместимость переливаемой крови можно обеспечить индивидуальным подбором донора (см. п.7).
6. Специальный выбор донора
Специальный выбор донора (донорской крови) производится на СПК или ОПК в тех случаях, когда установлена форма и специфичность имеющихся у больного антител, а на СПК или ОПК имеются доноры, типированные по этим антигенам. Выбор производится из числа лиц одногруппных по системе АВО и резус-принадлежности.
Если предполагается переливать эритроциты, освобожденные от плазмы, можно использовать также и разногруппную кровь, но совместимую в отношении эритроцитов донора.
В этих случаях эритроциты группы О(I) можно переливать реципиентам любой группы, а реципиентам группы АВ(IV) - эритроциты любой группы крови, но в обоих случаях одноименные по резус-принадлежности.
Далее выбираются доноры, не содержащие в крови антигенов, против которых у больного обнаружены антитела. После такого специального выбора донора, эритроциты которого не содержат антигенов, против которых у больного выявлены изоиммунные антитела, кровь этого донора следует проверить в пробах на совместимость с сывороткой больного с обязательным включением того метода, в котором оказались активными антитела больного. Затем, при благоприятном результате этих исследований, от донора заготавливается кровь (или берется кровь, заготовленная от него ранее) и передается в лечебное учреждение специально для этого больного.
Несмотря на специальный выбор крови, врач должен перед трансфузией провести все контрольные исследования, предусмотренные в разделе 1,9 и только после этого он может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
В тех случаях, когда СПК или ОПК не располагают кровью доноров, типированных как необходимо для конкретного больного, подбор крови такому сенсибилизированному больному следует проводить индивидуально.
7. Индивидуальный подбор донора
Индивидуальный подбор донора (донорской крови) производится по следующим показаниям:
а) в тех случаях, когда трансфузиолог обнаружил несовместимость в пробах по группам крови АВО или резус-антигену и контрольная проверка исключает ошибки в отношении этих антнгенов и если при этом состояние больного позволяет отложить трансфузию, чтобы дополнительно исследовать кровь на изоиммунные антитела.
Подбор осуществляют, используя ту же реакцию, с помощью которой обнаружены антитела. Если агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по группам крови АВО, то подбор крови следует вести на плоскости при комнатной температуре. Если агглютинация наблюдалась при проведении пробы на совместимость по резус-антигену D, то подбор следует проводить, используя непрямую пробу Кумбса или реакции с использованием коллоидов (раздел IV, V).
Когда будет подобрана кровь, не дающая агглютинации с сывороткой больного, следует провести с ней все другие реакции, предусмотренные при переливании. В тех случаях, когда для переливания подбиралась кровь из флакончиков-спутников, врач должен повторить все исследования, взяв кровь непосредственно из контейнера, подготовленного для трансфузии. При отсутствии признаков несовместимости врач может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
Следует учесть, что если несовместимость выявлена только по группам крови АВО, а контрольные пробы исключают ошибку по этим антигенам, то это чаще всего бывает за счет антител анти-М или анти-N и подобрать совместимую кровь в этих случаях удастся обычно уже среди 5-6 образцов. Если несовместимость выявилась из-за наличия неполных антител, подбор может оказаться более трудным, но все же, если трансфузия срочная, можно попытаться найти совместимую кровь.
б) индивидуальный подбор проводится также в тех случаях, когда определены наличие и специфичность изоиммунных антител в крови больного, но СПК и ОПК не имеет возможности специально выбрать кровь из-за отсутствия типированного донора с подходящей для данного больного антигенной структурой. Подбор в этих случаях проводится с кровью, взятой из флакончиков-спутников, или с кровью, полученной непосредственно у доноров из пальца. Начинать подбор следует, используя ту реакцию, в которой оказались активными изоиммунные антитела. Если выявлены полные антитела, то следует учитывать и температуру, при которой они оказались активными.
Вероятность нахождения совместимой крови в таких случаях зависит от специфичности антител. При антителах с или е подбор следует вести из числа резус-положительных доноров. При этом обычно удается довольно быстро найти с-отрицательную кровь (16%), но значительно труднее е-отрицательную ввиду редкой встречаемости лиц, не содержащих этого фактора (2,5%).
Большая или меньшая трудность подбора крови при антителах другой специфичности будет зависеть также от частоты факторов, к которым направлены антитела. Особенно затруднен подбор бывает при наличии антител к фактору Челлано, выявленному у 99,85% лиц, а также в случае сочетания антител разной специфичности.
После такого индивидуального подбора кровь, заготовленная от доноров, передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
в) индивидуальный подбор крови донора следуют проводить также в тех случаях, когда у больного выявлены изоиммунные антитела, но не установлена их специфичность. Это может быть связано с ограниченностью на СПК (ОПК) образцов стандартных эритроцитов, типированных по изосеропогическим системам, а также, возможно, с наличием в крови больного антител к неизвестному до этого времени антигену. Подбор в таких случаях следует проводить, используя кровь из флакончиков-спутников или кровь, полученную непосредственно у донора из пальца, начиная его той же реакцией, с помощью которой оказались активными антитела больного. В таких случаях решить заранее вопрос, среди каких доноров легче подобрать кровь, бывает трудно. После такого индивидуального подбора кровь передается в лечебное учреждение для переливания данному больному.
8. Использование подобранной крови
Как специальный, так и индивидуальный подбор крови, производимой на СПК (ОПК), является предварительной процедурой. Врач-трансфузиолог, получив флакон с кровью, должен во избежание ошибки сверить паспортные данные на флаконе с данными о крови больного в истории болезни, произвести контрольные реакции - определение группы крови больного и донора и пробы на совместимость. При совпадении группы крови и резус-принадлежности больного и донора и отсутствии агглютинации в пробах на совместимость, врач может приступить к переливанию крови, начав его с биологической пробы.
9. Особенности пробы на совместимость у больных с
гемотрансфузионными осложнениями.
У больных, перенесших гемотрансфузионное осложнение, происходят характерные серологические сдвиги, заключающиеся в том, что в период до 10 - 20-го дня идет нарастание сенсибилизации, выражающееся в повышении титра антител, послуживших причиной осложнения, и в появлении антител другой специфичности. После 20-го дня начинается постепенное снижение титра антител и исчезновение их в порядке, обратном появлению. Поэтому таким больным в период нарастания сенсибилизации пробу на совместимость следует проводить с сывороткой, полученной от них непосредственно в день проведения трансфузии крови или не далее чем накануне. При переливании крови после 20-го дня, кроме этой пробы, желательно дополнительно проводить пробу на совместимость с порцией сыворотки, заготовленной на высоте сенсибилизации (10 - 20-й день). Это дает возможность предупредить переливание больному крови, содержащей антиген, против которого у него совсем недавно имелись антитела.
VIII. Записи о выборе крови и проведенных исследованиях
Врач, переливающий кровь, обязан записать в историю болезни:
1) паспортные данные с каждого контейнера с кровью - фамилию и инициалы донора, группу крови, резус-принадлежность, номер контейнера и дату заготовки крови;
2) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови больного;
3) результат контрольной проверки групповой принадлежности крови донора, взятой из контейнера;
4) результат пробы на совместимость по группам крови АВО;
5) метод и результат пробы на совместимость по резус-антигену D.
Записи скрепляются подписью врача.
IХ. Заключение
Самыми важными показателями, позволяющими судить о совместимости переливаемой крови (эритроцитов) являются совместимость по группе крови системы АВО и совместимость по резус-антигену D.
Для обеспечения совместимости переливаемой крови необходимо на основании определения группы крови реципиента и записи в истории болезни, а также документации на контейнере с кровью, правильно выбрать кровь в отношении групп крови системы АВО и резус-принадлежности (см. раздел 1. п.п. 6, 7).
Непосредственно перед переливанием крови, независимо от проведенных ранее исследований и имеющихся записей, врач обязан снова проверить групповую принадлежность реципиента и крови донора (раздел 1.9), сделать пробу на совместимость по группам крови АВО (раздел III) и одну из проб на совместимость по резус-антигену D (разделы IV, V, VI, VII).
Врач должен предусмотреть возможную несовместимость по отношению к другим антигенам и принять меры для ее предупреждения.
Если кровь (эритроциты) донора оказалась несовместимой с кровью реципиента в пробе на совместимость по группам АВО или в пробе на совместимость по резус-антигену D, она не должна быть ему перелита!
Если кровь (эритроциты) донора оказалась совместимой с кровью реципиента в пробах на совместимость по группам крови АВО и резус-антигену D и нет указаний на несовместимость по отношению к другим антигенам - кровь (эритроциты) может быть перелита.
Переливание начинается с биологической пробы.
Ответственным за выполнение перечисленных требований и обеспечение совместимости при переливании крови является врач специалист переливающий кровь.
"Инструкцию по предупреждению несовместимости при переливании крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 5 декабря 1990 года N 05-14/37-14, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 2
Инструкция
по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток
для определения групп крови системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Стандартными изогемагглютинирующими сыворотками являются сыворотки, приготовленные из крови людей и некоторых других жидкостей, содержащие групповые антитела (агглютинины). Сыворотки предназначаются для определения групповой принадлежности крови людей по системе АВО.
Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки представляют собой прозрачную жидкость, окрашенную в соответствии с групповой принадлежностью, и расфасованную в ампулы или флаконы. На этикетке указывают названия учреждения, изготовившего сыворотку, специфичность, титр агглютининов и срок годности.
I. Источники получения сывороток
Источниками для получения стандартных сывороток служат:
а) Кровь, заготовленная без консерванта от донора, предварительно обследованного и содержащего в крови групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
б) плазма, полученная при проведении плазмафереза или отделенная из донорской крови, по каким-либо причинам не использованная для лечебных целей и содержащая групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток;
в) дополнительный источник - плевральный транссудат, асцитическая жидкость, если в них содержатся групповые антитела с титром, достаточным для изготовления стандартных сывороток.
II. Условия пригодности стандартной изогемагглютинирующей сыворотки
К стандартной изогемагглютинирующей сыворотке предъявляются следующие требования:
а) сыворотка должна быть специфичной, то есть содержать определенные групповые антитела - альфа (анти-А), бета (анти-В) или оба антитела вместе, и не вызывать неспецифической агглютинации эритроцитов одноименной группы и группы О(I). Сыворотка группы АВ(IV), не содержащая групповых агглютининов, не должна вызывать агглютинации;
б) должна быть активной, что выражается в наступлении первых признаков агглютинации со стандартными эритроцитами групп А1 и В в течение первых 30 секунд и со стандартными эритроцитами группы А2 в течение первой минуты и титром агглютининов по отношению к эритроцитам групп А1 и В не ниже, чем 1:32 и группы А2 - не ниже, чем 1:16.
в) не должна оказывать на эритроциты гемолизирующего действия;
г) должна быть прозрачной. Допускается небольшая опалесценция, что не влияет на качество сыворотки;
д) должна быть окрашена: группа А(II) - в светлосиний цвет, группа В (III) - в красный цвет, группа АВ(IV) - в желтый цвет;
е) должна быть предохранена от инфицирования прибавлением консервирующих средств;
ж) должна иметь точную паспортизацию, т.е, обозначение групповой принадлежности, титра, срока годности, номера серии и наименования учреждения, ее изготовившего. Все эти сведения должны быть обозначены на этикетке, наклеиваемой на флакон (ампулу) со стандартной сывороткой, а также внесены в "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки", в который записывают также сведения о дате изготовления сыворотки и результатах контрольных проверок ее качества.
III. Основные этапы работы по приготовлению
стандартной изогемагглютинирующей сыворотки
1. Предварительное определение пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки путем взятия от него крови и отделения от нее сыворотки или путем получения плазмы с помощью проведения плазмафереза. Исследования производятся заранее в пробной порции крови, полученной непосредственно от донора в небольшом количестве.
2. Взятие крови от донора, отделение от нее сыворотки или получение плазмы от донора при помощи плазмафереза.
3. Предварительное определение пригодности плазмы, предполагаемой для передачи в сывороточное отделение для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
4. Обработка плазмы для получения из нее сыворотки.
5. Сбор остатков крови из флакончиков (пробирок) - спутников в общую емкость, отделение от нее сыворотки (плазмы) и предварительное определение пригодности для изготовления стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
6. Получение в лечебных учреждениях асцитической жидкости, плеврального транссудата, освобождение их от сгустков фибрина и предварительное определение пригодности этого материала для изготовления из него стандартной изогемагглютинирующей сыворотки.
7. Определение пригодности сыворотки, плазмы для изготовления из нее стандартной изогемагглютинирующей сыворотки, включающее:
а) определение групповой принадлежности сыворотки (групповых агглютининов);
б) определение способности сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию;
в) определение гемолизирующих свойств сыворотки;
г) определение активности сыворотки;
д) скорость наступления агглютинации;
е) титр агглютининов.
8. Предварительное заключение о пригодности сыворотки.
9. Консервирование сыворотки.
10. Первый контроль сыворотки до розлива.
11. Второй контроль сыворотки до розлива.
12. Фильтрование сыворотки.
13. Окрашивание сыворотки.
14. Окончательное заключение о пригодности сыворотки.
15. Розлив сыворотки.
16. Паспортизация разлитой сыворотки.
17. Контроль разлитой сыворотки.
IV. Методы серологических исследований
1. Определение групповой принадлежности сыворотки при помощи
стандартных эритроцитов.
Определение производится на белой фарфоровой или любой другой белой пластинке со смачиваемой поверхностью, на которой надписывают обозначения: слева "О", в середине "А" и справа "В". Соответственно каждому обозначению на пластинку наносят по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных эритроцитов групп O(I), А(II) и В(III). На каждую каплю эритроцитов капают одну большую каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки с тем, чтобы соотношение количества эритроцитов и сыворотки было приблизительно 1:10. Эритроциты перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое, потом снова покачивают и одновременно наблюдают результат. Наблюдение проводят в течение 5 минут. Через 3-5 минут в каждую каплю, в которой наступила агглютинация, добавляют 1 каплю (0,1 мл) изотонического раствора NаСl и снова покачивают пластинку.
Результат учитывают по наличию или отсутствию агглютинации в каждой капле. При этом возможны четыре варианта:
- агглютинация наступила с эритроцитами групп А(II) и В(III), но отсутствует с эритроцитами группы О(I). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке двух агглютининов альфа (анти-А) и бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Оальфа бета(I);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы В(III) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и А(II). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина бета (анти-В), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Абета(II);
- агглютинация наступила с эритроцитами группы А(II) и отсутствует с эритроцитами групп О(I) и В(III). Это указывает на наличие в испытуемой сыворотке только агглютинина альфа (анти-А), т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе Вaльфа(III);
- агглютинация отсутствует с эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие групповых агглютининов, т.е. на принадлежность испытуемой сыворотки к группе АВ(IV).
2. Определение способности сыворотки вызывать неспецифическую
агглютинацию.
Эти исследования можно проводить одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов.
Дополнительно в исследование включают 6-8 образцов эритроцитов группы О(I) и одногруппных с исследуемой сывороткой.
Наблюдение результатов с эритроцитами одноименной группы и группы О(I) проводят до 20 минут.
Если испытуемая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов одноименной группы и группы О(I), это значит, что она обладает свойством вызывать неспецифическую агглютинацию. В этих случаях учитывают скорость ее наступления и интенсивность.
3. Определение гемолизирующих свойств сыворотки.
Гемолизирующие свойства сыворотки выявляются одновременно с определением групповой принадлежности при помощи стандартных эритроцитов. Если при смешивании с эритроцитами сыворотка вызывает их гемолиз, значит, сыворотка обладает гемолизирующими свойствами.
4. Определение скорости наступления агглютинации.
Скорость наступления агглютинации определяют так же, как групповую принадлежность - при помощи стандартных эритроцитов, но с дополнительным включением в реакцию стандартных эритроцитов группы А2. Скорость наступления агглютинации учитывают с помощью секундомера от момента перемешивания сыворотки с эритроцитами до момента наступления первых признаков агглютинации отдельно по отношению к эритроцитам групп А1, А2 и В.
5. Определение титра агглютининов.
Для определения титра агглютининов в исследуемой сыворотке приготавливают разведения ее в изотоническом растворе NаСl. Для этого в штатив ставят 10 пробирок и в каждую из них вносят градуированной пипеткой по 1 мл изотонического раствора NаСl. Затем в первую пробирку той же пипеткой добавляют 1 мл испытуемой сыворотки и перемешивают ее с изотоническим раствором путем встряхивания пробирки. Из этой пробирки 1 мл смеси переносят во вторую и снова перемешивают и так до последней пробирки. В результате в пробирках образуются разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
Непосредственно на пластинке можно приготовить разведения сыворотки в арифметической прогрессии. Для этого следует сделать в пробирке первое исходное разведение (любое).
Например, к одной капле сыворотки добавить 15 капель изотонического раствора хлорида натрия, получив таким образом разведение 1:16. Эту разведенную сыворотку нанести в 6 пронумерованных точек на пластинку: в первую точку - 2 капли, во вторую, третью и все последующие - по 1 капле. Затем добавить изотонический раствор: во вторую точку - 1 каплю, в третью - 2 капли, в четвертую - 3 капли, в пятую - 4 капли, в шестую - 5 капель. Капли перемешивают стеклянной палочкой, начиная с последней точки в направлении к первой. Так получают разведения сыворотки на пластинке: 1:16, 1:32, 1:48, 1:64, 1:80, 1:96.
При определении титра агглютинина альфа2 по отношению к эритроцитам А2 приготавливают дополнительно промежуточное разведение сыворотки 1:24.
Разведения сыворотки можно приготовить, отмеряя сыворотку и изотонический раствор NаСl каплями, для чего используют одну и ту же пипетку.
На пробирках отмечают степень разведения сыворотки. Далее 0,1 мл (одну большую каплю) каждого разведения сыворотки переносят на пластинку, предварительно надписав на ней обозначения степени разведения сыворотки: 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024
Разведения сыворотки можно приготавливать также непосредственно на пластинке. Для этого в десять пронумерованных точек наносят по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl, в первую точку добавляют одну каплю (0,1 мл) испытуемой сыворотки, перемешивают капли, затем той же пипеткой переносят одну каплю смеси во вторую точку и т.д. до десятой, получая таким образом разведения сыворотки от 1:2 до 1:1024.
На пластинку рядом с каждой каплей разведенной сыворотки наносят маленькую каплю (0,01 мл) стандартных эритроцитов соответствующей группы, т.е. эритроциты А, и А2, когда титруют агглютинины альфа и эритроциты группы В, когда титруют агглютинины бета. Соотношение эритроцитов и сыворотки должно быть 1:10.
Каждую каплю стандартных эритроцитов тщательно перемешивают с сывороткой сухой стеклянной палочкой, после чего пластинку покачивают, затем оставляют на 1-1,5 минуты в покое, снова покачивают и одновременно наблюдают результат в течение 5 минут.
Наибольшее разведение сыворотки, в котором наступила агглютинация стандартных эритроцитов до истечения 5 минут, принимают за титр агглютининов в этой сыворотке.
V. Предварительное заключение о пригодности крови для
изготовления из нее стандартной сыворотки
Основным показателем пригодности крови донора для изготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов.
Скорость наступления агглютинации должна быть не более чем 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В и не более 1 минуты с эритроцитами группы А2.
Титр сыворотки должен быть: для агглютинина альфа не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1, не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2, и для агглютинина бета не ниже, чем 1:32 к эритроцитам В.
При предварительном исследовании непосредственно взятой пробной порции крови титр агглютининов должен быть, хотя бы на одно разведение выше, в виду возможного его падения в процессе обработки и консервирования основной порции крови.
Одновременно следует учитывать, не вызывает ли сыворотка крови неспецифической агглютинации или гемолиза эритроцитов.
Если сыворотка вызывает слабую неспецифическую агглютинацию эритроцитов позднее, чем через 2 минуты, то это не является противопоказанием к использованию этой крови, так как эти свойства при дальнейшей обработке сыворотки обычно исчезают.
Если сыворотка вызывает неспецифическую агглютинацию ранее 2 минут, то брать у донора кровь для приготовления стандартной сыворотки не следует.
Гемолизирующих свойств крови у доноров обычно не наблюдается, но если это имеет место, то брать кровь у донора не следует.
В этом случае так же, как и при выраженной неспецифической реакции, донора следует подвергнуть дополнительному медицинскому обследованию.
Доноров, кровь которых соответствует требованиям, предъявляемым к стандартным сывороткам, следует брать на особый учет с целью дальнейшего использования их крови для изготовления стандартных сывороток.
VI. Взятие крови у донора и отделение от нее сыворотки
Кровь у донора берут из вены в сухой стерильный сосуд. Через 15-30 минут сосуд с кровью встряхивают для отделения свертка от стенки и затем помещают на сутки в холодильник при 4-8°С. Отделившуюся за это время сыворотку отсасывают или сливают в другой сосуд, а сосуд со свертком оставляют еще на одни сутки при 4-8°С. Обычно через одни сутки из свертка отделяется еще некоторое количество сыворотки, которую присоединяют к первой порции. Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки, или азидом натрия из расчета 1 г на 1 мл сыворотки.
Для ускорения свертывания крови сосуд можно поставить сначала на один час в термостат, а затем в холодильник.
Паспортизация. На сосуде с кровью, а затем с сывороткой надписывают паспортные данные, т.е. фамилию, имя и отчество донора, групповую принадлежность, дату взятия крови, количество крови и полученной из нее сыворотки, а также результат исследования пробной порции крови. Эти же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки" (Дальнейшая обработка см. пункт IХ).
Получение сыворотки из крови, оставшейся во флакончиках (пробирках) - спутниках после взятия ее у доноров.
Для изготовления сыворотки может быть использована кровь из флакончиков (пробирок) - спутников. Для этого остатки крови сливают (каждую группу отдельно) в сухие флаконы. На флаконе надписывают группу крови и дату заготовки.
VII. Получение сыворотки из плазмы
При получении сыворотки из плазмы из последней удаляется фибрин. Это можно осуществить несколькими способами:
1. К плазме прибавляют раствор хлорида кальция из расчета 3 мл 20% или 6 мл 10% на 100 мл плазмы. Через 30-40 минут во флаконе образуется сверток. Если сверток пристал к стенке, то флакон следует встряхнуть, чтобы сверток отделился. Флакон с содержимым оставляют на двое суток в холодильнике, после чего отделившуюся сыворотку переливают через воронку с марлей в другой флакон. Сыворотку консервируют и на флакон переносят паспортные данные.
Иногда во флаконе с сывороткой через некоторое время снова выпадает сверток фибрина; в этих случаях сыворотку еще раз переливают через воронку с марлей (с тканью) в другой флакон.
2. К плазме добавляют равный объем одногруппной сыворотки с титром антител не ниже 1:32. Содержимое флакона перемешивают, оставляют на одни сутки при комнатной температуре и затем помещают в холодильник на 10-14 дней. На паспорте флакона дописывают сведения о дате и количестве добавленной сыворотки.
За 10-14 дней образуется плотный сверток фибрина и, кроме того, может исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую, агглютинацию эритроцитов.
Отделившуюся сыворотку сливают в другой флакон через воронку с тканью, сыворотку консервируют, на флакон наносят паспортные данные.
Паспортизация. Паспортные записи о плазме переносят с флакона на флакон по мере отделения сыворотки. К ним добавляют запись о дате получения сыворотки. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
Дальнейшая обработка сыворотки (см. пункт IХ).
VIII. Получение сыворотки из плеврального транссудата
и асцитической жидкости
В тех случаях, когда в процессе лечения больному делается пункция грудной или брюшной полости с целью удаления жидкости, последнюю можно использовать для изготовления стандартной сыворотки. Для этого жидкость собирают в чистую посуду. По доставлении в лабораторию жидкость переливают во флакон через воронку с марлей или тканью для отделения свертка (если он имеется) и консервируют борной кислотой или азидом натрия, как указано выше.
Паспортизация. На флаконе надписывают сведения о том, из чего сыворотка приготовлена, и дату. Те же сведения записывают в "Журнал регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
IХ. Дальнейшая обработка и предварительное заключение
о пригодности сыворотки, полученной из любых источников
1. Серологические исследования.
В сыворотке определяют:
а) групповую принадлежность (групповые агглютинины);
б) гемолизирующие свойства;
в) способность вызывать неспецифическую агглютинацию;
г) активность, т.е. скорость наступления агглютинации и ее выраженность;
д) титр агглютининов.
Методы исследования (см. пункт IV)
На основании этих исследований делают предварительное заключение о пригодности сыворотки. Основными показателями являются скорость наступления агглютинации и титр антител.
2. Сыворотку предварительно считают пригодной, если она вызывает агглютинацию эритроцитов групп А1 и В не позднее чем через 30 секунд, а эритроцитов группы А2 не позднее чем через 1 минуту, и если титр агглютининов в ней не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам групп А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам группы А2.
При этом также следят за тем, чтобы сыворотка не имела красной или бурой окраски.
Если агглютинация наступает позднее или титр агглютининов ниже, сыворотку считают непригодной.
Наличие неспецифической агглютинации или гемолизирующих свойств на этой стадии изготовления сыворотки не делает ее непригодной, что позволяет сохранить до 1-го контроля (пункт ХI).
3. Паспортизация. Результаты всех исследований, перечисленных в этом разделе, записывают на флаконе с сывороткой и в "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной cыворотки".
Х. Консервирование сыворотки
Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, и сыворотку, полученную из любого другого источника и признанную предварительно годной, консервируют.
Наиболее пригодным консервантом является борная кислота, которую прибавляют из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия 1 г на 1 мл.
После прибавления консерванта сыворотку оставляют на срок 10-12 дней. За этот срок в ней, с одной стороны, может снизиться титр агглютининов, с другой - исчезнуть свойство вызывать гемолиз или неспецифическую агглютинацию, если это имело место. Сыворотку, имеющую высокий титр агглютининов, разрешается разводить изотоническим раствором NаСl до титра не ниже 1:64 и соответственно количеству разводителя добавляют борную кислоту или азид натрия.
ХI. Первый контроль сыворотки до розлива и оценка
пригодности ее для дальнейшей обработки
1. Первый контроль производится через 10-12 дней после поступления сыворотки, ее предварительного испытания и консервирования. Он заключается в следующем:
а) проверяют правильность паспортизации сыворотки, т.е. сверяют записи на флаконе и в журнале;
б) определяют групповую принадлежность при помощи стандартных эритроцитов и результат сверяют с обозначением группы крови на флаконе и в журнале;
в) одновременно с определением групповой принадлежности проверяют способность сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
г) проверяют, нет ли в сыворотке признаков инфицирования, не помутнела и не потемнела ли она;
д) проверяют активность сыворотки, т.е. скорость наступления агглютинации и титр агглютининов;
е) результаты всех исследований записывают на флаконе и в журнал.
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делается при следующих условиях: если паспортные записи произведены правильно, в сыворотке нет признаков инфицирования, если она не помутнела, не потемнела и обладает достаточной активностью.
Под достаточной активностью при первом контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б. при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился более, чем на два разведения по сравнению с исходными цифрами.
Если сыворотка отвечает этим условиям, ее считают пригодной для дальнейшей обработки и оставляют еще на 10-12 дней, после чего производят второй контроль (см. п.ХIV).
При снижении титра более, чем на две ступени (даже если титр сыворотки после снижения остался равным или выше, чем 1:32) сыворотку считают непригодной.
При наличии признаков инфицирования, значительного потемнения и помутнения сыворотку считают непригодной.
При первом контроле сыворотки явления неспецифической агглютинации и гемолизирующие свойства наблюдаются редко, потому что эти свойства обычно исчезают за время хранения сыворотки с консервантом. Если эти свойства все же сохранились, это не делает сыворотку непригодной для дальнейшей обработки, так как при некоторых условиях они могут быть устранены в течение времени, предшествующему второму контролю сыворотки.
XII. Устранение свойства сыворотки вызывать
неспицифическую агглютинацию
Устранение свойства сыворотки вызывать неспецифическую агглютинацию может быть достигнуто путем разбавления ее изотоническим раствором NаСl. Это допускается только для сыворотки групп О(I), А(II) и В(III) и только при высоком титре агглютининов в ней - не ниже, чем 1:64 - и при этом титре не более, чем половинным объемом изотонического раствора по отношению к объему сыворотки (с добавлением соответствующего количества борной кислоты или азида натрия). Предварительно испытывают ряд пробных разведений сыворотки, приготовленных в небольших количествах. Наблюдение проводят в течение 20 мин. После подбора разведения, устраняющего неспецифическую агглютинацию, разводят всю сыворотку.
Если разведение изотоническим раствором NаCl не устраняет неспецифической агглютинации, сыворотку считают непригодной.
Разведение сыворотки группы АВ(IV) не допускается. Сыворотку, вызывающую хотя бы незначительную неспецифическую агглютинацию, считают непригодной.
XIII. Устранение гемолизирующего действия сыворотки
Для устранения гемолизирующего действия сыворотки ее прогревают при 56°С в течение одного часа. Если такое прогревание не устраняет гемолизирующего действия, сыворотку считают непригодной.
ХIV. Второй контроль сыворотки до розлива и оценка ее
пригодности для дальнейшей обработки
1. Второй контроль производят через 10-12 дней после первого (приблизительно через 20-24 дня после начала обработки сыворотки) и проводят так же, как первый контроль (см. раздел ХI).
2. Заключение о пригодности сыворотки для дальнейшей обработки делают при следующих условиях: если паспортные записи сделаны правильно, сыворотка не инфицирована, не помутнела, не потемнела, не вызывает неспецифической агглютинации и гемолиза эритроцитов и достаточно активна.
Под достаточной активностью при втором контроле понимают соответствие требованиям, указанным в разделе II.б, при условии, что титр не только соответствует этим требованиям, но и не снизился по сравнению с цифрами, полученными при первом контроле.
В других случаях сыворотку считают непригодной.
ХV. Смешивание сывороток
Для максимального использования сырья и упрощения контроля за образцами разлитой сыворотки допускается смешивание нескольких порций одногруппных сывороток после второго контроля их, до розлива (раздел ХIХ). Предварительно из каждой порции берут по 1-2 мл сыворотки и в смеси их определяют титр агглютининов. Затем титр проверяют еще раз через 2-3 дня и если он не изменился, то смешивают основные сыворотки. Сыворотку-смесь обозначают новым номером и ее снова испытывают, аналогично второму контролю (раздел ХIY).
ХVI. Окрашивание сыворотки
Дополнительным условием, предупреждающим ошибки при определении группы крови, является окрашивание сывороток.
Окрашивание можно производить до фильтрации, если предполагается фильтровать сыворотку через бумажный фильтр. При использовании фильтра Зейтца сыворотку окрашивают после фильтрации.
Сыворотку группы А(II) окрашивают в синий (или сине-зеленый) цвет,
сыворотку группы В(III) - в красный цвет,
сыворотку группы АВ(IV) - в желтый цвет (см. дополнение п.ХХХ).
ХVII. Фильтрование сыворотки
Сыворотку, признанную пригодной, фильтруют. Сыворотку, полученную из крови, взятой непосредственно у донора, обычно достаточно профильтровать через бумажный фильтр. Сыворотку, полученную из других источников, необходимо фильтровать через фильтр Зейтца со стерилизующей прикладкой. Такое фильтрование просветляет сыворотку и предупреждает развитие инфекции. Немедленно после фильтрования сыворотку окрашивают (см. Дополнение 2).
ХVIII. Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Окончательное заключение о пригодности сыворотки делают после ее фильтрования.
Сыворотку считают пригодной, если она:
а) специфична, т.е. содержит агглютинины альфа или бета, или оба вместе и не вызывает неспецифической агглютинации эритроцитов;
б) активна, т.е. вызывает первые признаки агглютинации в течение первых 30 секунд с эритроцитами групп А1 и В, и в течение одной минуты с эритроцитами группы А2 и имеет титр агглютининов не ниже, чем 1:32 по отношению к эритроцитам А1 и В и не ниже, чем 1:16 по отношению к эритроцитам А2.
Для окончательного заключения о пригодности сыворотки, кроме абсолютной величины титра, принимают во внимание его динамику (см. раздел XI, первый контроль и раздел ХIV, второй контроль);
в) не оказывает на эритроциты гемолизирующего действия;
г) прозрачная. Допускается небольшая опалесценция;
д) предохранена от инфицирования консервированием;
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6