Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2 "Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года
Страница 5
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или реакцией конглютинации с применением желатина для выявления неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для выявления полных антител.
С целью сокращения объема работы при первичном исследовании
сывороток следует использовать эритроциты с содержанием возможно
больного числа антигенов в одном образце; удобнее всего фенотип СсDЕе,
а
К+, Fу +, Jk+.
В случае отсутствия типированных эритроцитов для выявления антител следует приготовить смеси эритроцитов группы О(I) по 5-6 образцов и использовать 3-4 таких смеси в качестве стандартов, считая каждую смесь за один образец.
Для изготовления стандартов можно использовать эритроциты из осадка крови, взятой из вены со стабилизатором или из места укола пальца.
При массовых исследованиях крови выявление изоиммунных антител
можно производить одновременно с определением резус - принадлежности,
подвергая испытанию сыворотку каждого исследуемого лица. При этом
допустимо предварительно исследовать сыворотку методом конглютинации с
желатиной с помощью одного "стандарта" эритроцитов. В качестве такого
стандарта следует использовать смесь 2-3 образцов резус-положительных
w
эритроцитов группы О(I), содержащих антигены D, С, Е, с, е, С , Келл, Fу
и другие.
Кровь лиц, в сыворотке которых выявлены антитела, исследуется далее в лабораториях институтов, станций переливания крови, где устанавливается специфичность, активность и форма антител.
8. Исследование сывороток на специфичность, активность
и форму антител
Исследование сывороток начинается с проверки групповой принадлежности по системе АВО. Затем сыворотка исследуется на специфичность, активность и форму антител. Для исследования применяется непрямая проба Кумбса, метод конглютинации с применением желатина, реакция агглютинации в солевой среде. Следует иметь ввиду, что в одной и той же сыворотке могут содержаться как полные, так и неполные антитела, причем их специфичность может совпадать или быть различной. Так, например, сыворотка может содержать неполные антитела анти-D, анти-С и анти-Е и в то же время полные антитела анти-С и анти-Е или только полные анти-Е. Титр полных и неполных антител также может быть различен.
Широта исследований зависит от возможности станции переливания крови. В тех случаях, когда станция не располагает всеми указанными ниже стандартными типированными эритроцитами, для дальнейшего исследования сыворотка должна передаваться в республиканские станции или в институты переливания крови.
Для полного выявления антител, установления их специфичности, формы и титра следует использовать панель типированных стандартных эритроцитов. Для удобства в панели целесообразно использовать эритроциты группы О(I).
В качестве образцов в панель можно включать эритроциты типированных доноров, для чего берут у них кровь из вены в изотонический раствор цитрата натрия или консервант. Эритроциты перед употреблением отмывают двукратно изотоническим раствором хлорида натрия. Срок хранения таких эритроцитов до отмывания - 2-3 дня, после отмывания - 1 день.
Если кровь взята у донора в стерильных условиях в контейнер с консервантом, применяемым для консервирования крови, она может храниться 1 месяц при +4-8 °С. Перед использованием эритроциты двукратно отмывают изотоническим раствором хлорида натрия. Срок годности отмытых эритроцитов 1 день.
Более эффективно использование эритроцитов доноров редких групп, сохраняемых в замороженном состоянии, лучше в малых объемах - 2-5 мл. Для использования эритроциты отмывают специальными растворами (см. действующие методические рекомендации "Методы долгосрочного хранения в замороженном состоянии эритроцитов, предназначенных для трансфузии"). После отмывания эритроциты используются в тот же день.
В панели должны быть представлены стандартные эритроциты, позволяющие выявлять и идентифицировать антитела в пределах следующих систем: Rh-Нr, Даффи, Келл, Кидд, Левис, МNSs, Лютеран, Р. В зависимости от возможности учреждения, эта панель может быть расширена за счет увеличения образцов или уменьшения, но так, чтобы по возможности были включены как положительные, так и отрицательные образцы для каждого антигена.
Панель включает резус-положительные и резус-отрицательные образцы эритроцитов разных фенотипов. Среди резус-положительных содержащие пять антигенов системы резус - СсDЕе. В этих же образцах имеются в том или ином сочетании антигены всех других систем. Таким образом положительная реакция с этими образцами укажет на наличие в сыворотке любых антител, но без уточнения их специфичности.
Следующие резус-положительные образцы относятся к фенотипам ССDЕе, СсDЕЕ, СсDее, ССDее, ссDЕе и ссDЕЕ. Часть их гомозиготна, а часть - гетерозиготна по антигенам С и Е. Эти образцы необходимы для идентификации антител анти-с и анти-е.
Затем следуют образцы фенотипов ссDеe, Ссddde и сссdEe. Эти образцы дают возможность выявлять специфичность антител в системе резус, причем очень ценным является образец с двойным содержанием антигена С (фенотип ССdее). Этот образец даст возможность идентифицировать антитела в очень редких сыворотках, например, анти-D + анти-с.
Среди резус-положительных образцов в панели должны быть
u w u
разновидности с содержанием антигена D и антигена С . Образец D служит
для того, чтобы установить достаточно ли активны антитела анти-D.
w w
Образец с содержанием антигена С служит для выявления антител анти-С .
Панель включает резус-отрицательные образцы, положительная реакция
с которыми указывает на наличие антител по другим системам. Эти образцы
содержат разнообразные сочетания антигенов других систем: положительные
a b
и отрицательные по антигенам Fу , Fу и Кидд.
Необходимы Келл - положительные образцы. Некоторые из них чрезвычайно редкого фенотипа, не содержащего второго аллеля этой системы, т.е. Челлано - отрицательные. Келл - положительные образцы подразделяются также в зависимости от наличия или отсутствия в них антигенов Даффи.
Исследование сыворотки с этими образцами позволяет выявить специфичность в пределах этих систем и это очень важно, так как антитела анти - Келл и анти-Даффи являются следующими по частоте после антител антирезус.
Дальнейшее подразделение резус-отрицательных образцов включает
различия по системе Кидд и Левис с наиболее редкими фенотипами этой
а-- b-+ a+ b-
системы -Jk ; Jk ; Le ; Le .
И наконец в панели представлены фенотипы по другим системам МNSs, Р, Лютеран, причем наибольшую ценность представляют различия по этим системам внутри группы резус-отрицательных образцов.
Использование представленной панели стандартных эритроцитов дает возможность выявлять и определять специфичность полных и неполных антител всех серологических систем как в том случае, когда эти антитела одной специфичности, так и в том - когда антитела различаются и по специфичности и по форме.
В практической работе исследование следует начинать следующим
порядком: сначала используются выборочно 10-12 образцов эритроцитов,
подобранных с таким расчетом, чтобы выявить сенсибилизацию к любому из
w
основных антигенов резус - D, С, Е, с, е, С . Среди резус-отрицательных
включаются образцы также с максимальным набором различных других
антигенов.
Если сыворотка содержит резус-антитела какой-либо одной специфичности или их сочетание, то агглютинация наступит также с соответствующими образцами эритроцитов.
Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные образцы, имеющие антигены Fу или Келл, то следует произвести дополнительные исследования с включением образцов эритроцитов различного фенотипа по этим антигенам. Если сыворотка агглютинирует резус-отрицательные эритроциты независимо от антигенов Fу и Келл, то панель для исследования следует еще более расширить с включением образцов с различными сочетаниями по системам Кидд, Левис, МNSs и т.д.
Если сыворотка агглютинирует все образцы, взятые для первичного исследования, независимо от резус-принадлежности, то проводятся дополнительные исследования с использованием стандартов, гомозиготных по антигенам С и Е, т.е. не содержащих антигена с и антигена е. Отсутствие агглютинации с этими образцами свидетельствует о наличии соответствующих антител - анти-с и анти-е. При наличии агглютинации с указанными фенотипами следует иметь ввиду другие, широко распространенные антигены, например Челлано и поэтому использовать Челлано - отрицательные стандарты. В случае положительного результата и с этим стандартом следует расширить панель с включением образцов одновременно отрицательных по многим антигенам, так как в этих случаях можно предположить наличие в сыворотке нескольких антител.
Титрование сыворотки. После выявления антител и установления их специфичности и формы следует определить титр антител. Титрование проводится отдельно для неполных и полных антител, непрямой пробой Кумбса, в методе конглютинации с желатином и реакцией агглютинации в солевой среде, аналогично титрованию сывороток антирезус (см. инструкцию "По исследованию сывороток на наличие резус-антител"). Для титрования используются образцы эритроцитов, содержащие антиген против которого направлены антитела. По возможности титрование проводится с гомозиготными и гетерозиготными образцами. Для антител анти-с это является обязательным, так как эти антитела обладают выраженным феноменом дозы и будучи активными с гомозиготными образцами (сс) могут оказаться неактивными и дать ложноотрицательный результат при исследовании гетерозиготных образцов (Сс). При решении вопроса о возможности практического использования таких сывороток учитывается титр с гетерозиготным образцом и этот титр указывается на этикетке.
Описанное в настоящем разделе исследование сыворотки даст возможность решить вопрос о специфичности антител, содержащихся в сыворотке, а также об их форме и активности (титре). Далее каждая сыворотка, имеющаяся в достаточном количестве, для дальнейшего ее использования должна быть обработана и расфасована как указано в пункте 10. Расфасованные сыворотки хранятся в течение 3 недель после чего проводится их стандартизация.
9. Стандартизация сыворотки
Стандартизация редких сывороток производится на областных станциях переливания крови, располагающих необходимыми стандартами, или на станциях и в институтах переливания крови. При стандартизации производятся исследования, предусмотренные в параграфе 8. Результаты сопоставляются с данными, указанными на этикетке, оценивается внешний вид сыворотки, качество укупорки флаконов, ампул и правильность оформления этикеток.
При стандартизации окончательно решается вопрос о том, какой специфичности, формы и титра антитела содержатся в данной сыворотке и для определения какого (каких) антигенов и в какой именно реакции пригодна данная сыворотка.
Если качество сыворотки отвечает требованиям, изложенным в пункте 6, титр в ней сохранился или снизился, но не стал ниже требуемого и при этом правильно оформлены этикетки и наставление по использованию, то учреждение, проводившее стандартизацию, дает заключение о возможности использования данной сыворотки как стандартного реактива. Это заключение сообщается в учреждение, представившее сыворотку для стандартизации.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с указанием причин непригодности сыворотки или неправильности имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае несоответствия сыворотки необходимым требованиям в учреждение, изготовившее сыворотку, также сообщаются результаты с указанием причин непригодности сыворотки или неправильности имеющейся в ее паспортизации. При этом даются рекомендации по возможному устранению отмеченных недостатков.
В случае затруднений проведения стандартизации (наличие каких-либо неизвестных антител и т.п.) редкие сыворотки могут направлаться в Центр по изучению и стандартизации групп крови в ГНЦ РАМН.
Центр по изучению и стандартизации групп крови производит также выборочный контроль редких сывороток, изготавливаемых в учреждениях Службы крови страны.
10. Обработка и расфасовка сыворотки
После того, как у сенсибилизированного лица при первичном исследовании его сыворотки выявлены редкие антитела, от него получают сыворотку или плазму (методом плазмафереза). Сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 грамма на 100 мл сыворотки или азида натрия 1 г на 1000 мл. К плазме для удаления фибрина добавляют 10% раствор хлорида кальция из расчета 6 мл на 100 мл плазмы и после ретракции сгустка отсасывают сыворотку в другой флакон и так же консервируют.
На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием фамилии и.о. донора, групповой принадлежности по системе АВО и характеристики изоиммунных антител с теми подробностями, которые удалось выявить при первичном исследовании. Через два-три дня (можно несколько позже) сыворотку вновь исследуют на наличие, специфичность, форму и титр антител, как указано в пункте 8. Результат исследования записывают на этикетке сосуда с сывороткой и регистрируют в журнале.
Если в сыворотке выявлены активные редкие антитела и имеется возможность получить от сенсибилизированного лица еще некоторое количество сыворотки, эту новую порцию исследуют так же, как сказано выше. Флаконы с сывороткой хранят при +4-8°С.
Если показатели специфичности и активности (титра) антител и внешний вид сыворотки отвечают требованиям, указанным в пункте 6, сыворотку можно считать пригодной для практического использования и разлить в ампулы или маленькие флаконы по 1, 2, 3 или 5 мл в зависимости от предполагаемых объемов использования. Чем большая редкость антител, тем меньшие объемы рекомендуются для расфасовки сыворотки.
Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают и этикетируют.
Через три недели после розлива в сыворотке вновь исследуется специфичность, форма и активность антител, проверяется правильность паспортизации и решается вопрос о возможности использования этой сыворотки и методе, рекомендуемом для практической работы.
Для удаления антител системы АВО сыворотки рекомендуется абсорбировать. Абсорбция проводится эритроцитами соответствующей групповой принадлежности с отсутствием в них антигена, против которого в сыворотке имеются изоимунные антитела. Адсорбция или нейтрализация антител альфа и бета проводится после исследования сыворотки на наличие, специфичность, активность и форму антител до ее расфасовки.
После абсорбции и еще через три неделя сыворотку исследуют на наличие в ней групповых антител, а также специфичность, форму и титр изоиммунных антител. Если групповые антитела альфа и бета исчезли, а показатели изоиммунных антител отвечают требованиям, указанным в пункте 6, сыворотку можно расфасовать.
11. Паспортизация сыворотки
На ампулы (флаконы) с расфасованной сывороткой наклеивают этикетки, на которых указывают название учреждения и город, где изготовлена сыворотка, номер серии (или символ, избранный для ее обозначения), например, сокращенная фамилия донора, специфичность антиэритроцитарных антител, их форму. Указывается также групповая принадлежность по системе АВО. Для сыворотки группы АВ(IV) или, специально абсорбированной, вместо символа, обозначающего групповую принадлежность, пишутся слова "для всех групп крови". На этикетках наносятся по диагонали цветные полосы: для группы А(II) - две синие, для группы В(III) - три красные, для сыворотки с символом "для всех групп крови" - четыре желтые.
На этикетках указывается количество, срок годности и условия хранения.
Примеры наставлений по использованию редких сывороток
------------------------------------------------------------------------¬ ¦ Станция переливания крови КЗ г. Москвы ¦ +-----------------------------------------------------------------------+ ¦ Стандартная сыворотка для определения ¦ ¦ антигенов эритроцитов ¦ ¦ методом конглютинации с желатином в пробирках ¦ ¦ ¦ ¦ Метод использования: ¦ ¦1. В пробирку к одной капле сыворотки (0,05 мл) добавить одну каплю¦ ¦испытуемых эритроцитов (0,05 мл) и 2 капли желатина (0,1 мл). Содержи-¦ ¦мое перемешать путем встряхивания. ¦ ¦ ¦ ¦2. Инкубировать в термостате при +48 - +50°С в течение 30 минут или¦ ¦в водяной бане при +48 - +50°С в течение 15 минут. ¦ ¦ ¦ ¦3. После прогревания в пробирку долить 8 - 10 мл физиологического раст-¦ ¦вора, содержимое перемешать путем перевертывания пробирки. ¦ ¦ ¦ ¦4. Учесть результат реакции. ¦ ¦Во всех сомнительных случаях результат оценить путем микроскопирования.¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Серия 85 анти-E для всех групп крови ¦ L------------------------------------------------------------------------ ------------------------------------------------------------------------¬ ¦ Станция переливания крови КЗ г. Москвы ¦ +-----------------------------------------------------------------------+ ¦ Стандартная сыворотка для определения ¦ ¦ антигенов эритроцитов ¦ ¦ в методе солевой агглютинации ¦ ¦ (в маленьких пробирках или на планшетах) ¦ ¦ Метод использования: ¦ ¦ ¦ ¦1. Приготовить 2% взвесь эритроцитов, дважды отмытых изотоническим рас-¦ ¦твором хлорида натрия. ¦ ¦ ¦ ¦2. К одной капле тест-сыворотки добавить одну каплю исследуемой взвеси¦ ¦эритроцитов ¦ ¦ ¦ ¦3. Инкубировать пробирки (планшеты) 1 час при температуре 37°С. ¦ ¦ ¦ ¦4. Учесть результаты реакции с помощью лупы. ¦ ¦ ¦ ¦ Серия 52 анти-С для всех групп крови ¦ L------------------------------------------------------------------------
12. Хранение и выдача сыворотки
Расфасованные редкие сыворотки хранят или в замороженном состоянии при температуре не выше -15°С или при +4-8°С.
Редкие сыворотки после стандартизации используются для нужд учреждений, в которых они изготовлены, и могут выдаваться в другие учреждения Службы крови.
При выдаче сыворотки к ней прилагают наставление по использованию, в котором указывают в каком методе для каждого из антител следует использовать данную сыворотку.
При хранении сыворотка контролируется один раз в месяц или (в целях экономии сыворотки) непосредственно перед выдачей. Срок годности редких сывороток при хранении в замороженном состоянии - один год, при хранении в условиях +4-8°С - четыре месяца. По истечении срока годности сыворотку проверяют и, если титр не снизился или снизился не более чем на два разведения и при этом сохранился не ниже требований, указанных в пункте 6, срок продляют еще на два месяца. Если через два месяца титр также сохранился - срок снова продляется.
"Временную инструкцию по изготовлению сывороток редких групп, предназначенных для определения различных изоантигенов эритроцитов человека", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 26 марта 1979 года N 06-14/3, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 13
Инструкция *(11)
по применению Цоликлона анти-С моноклонального
для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека
(Цоликлон анти-С Супер) ТУ 9398-207-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-С Супер предназначен для выявления антигена С системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с аллоиммунной анти-С сывороткой.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-С антитела продуцируются бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-С Супер изготавливается на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология производства реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-С Супер содержит IgМ антитела, которые вызывают прямую агглютинацию С+ эритроцитов. Реагент не содержит антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена С в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена С
Цоликлон анти-С Супер может быть использован в реакции агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение антигена С производится в нативной крови с консервантом, в крови без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1.1. На предварительно подогретую (35 - 40 °С) пластинку нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02 - 0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20 - 30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию агглютинации. Четкая реакция наступает через 30 - 60 секунд после смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5% суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона анти-С и эритроцитарной взвеси, тщательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37°С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500 - 3000 оборотах в минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные С+ и С-эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-С Супер - один год при температуре 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2-8°С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности. неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с результатами тестирования и 2 - 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-rh(С) моноклонального для определения антигена С системы резус на эритроцитах человека (Цоликлон анти - С Супер)", утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 14
Инструкция *(12)
по применению Цоликлона анти-Е моноклонального для определения
антигена Е системы резус на эритроцитах человека
(Цоликлон анти-Е Супер)
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-Е Супер предназначен для выявления антигена Е системы резус на эритроцитах человека в реакции прямой гемагглютинации и может применяться взамен или параллельно с аллоиммунной анти-Е сывороткой.
2. Основные свойства
2.1. Моноклональные человеческие анти-Е антитела продуцируются бессмертной гетерогибридомой клеточной линией. Цоликлон анти-Е Супер изготавливается на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител. Технология производства реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
2.2. Цоликлон анти-Е Супер содержит IgМ антитела, которые вызывают прямую агглютинацию Е+ эритроцитов. Реагент не содержит антител других специфичностей и пригоден для выявления антигена Е в эритроцитах любой группы.
3. Определение антигена Е
Цоликлон анти-Е Супер может быть использован в реакции агглютинации на плоскости, в пробирках, в микроплате. Определение антигена Е производится в нативной крови с консервантом, в крови без консерванта, в том числе взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
3.1. На пластинку нанести одну большую каплю реагента (примерно 0,1 мл), одну маленькую каплю исследуемой крови или эритроцитов (0,02 - 0,05 мл) и смешать.
3.1.2. Через 20 - 30 секунд после смешивания покачать пластинку.
3.1.3. Результат оценить визуально по наличию или отсутствию агглютинации. Четкая реакция наступает через 30 - 60 секунд после смешивания реагента с эритроцитами. Окончательный результат реакции следует учитывать через пять минут. Наиболее крупная и четкая агглютинация наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
3.2.1. Приготовить из отмытых исследуемых эритроцитов 5% суспензию в физиологическом растворе.
3.2.2. Внести в круглодонную пробирку по одной капле Цоликлона анти-Е и эритроцитарной взвеси, тшательно перемешать.
3.2.3. Оставить пробирку на тридцать минут при температуре 37°С.
3.2.4. Центрифугировать пробирку при 1500 - 3000 оборотах в минуту в течение тридцати секунд.
3.2.5. Осторожно встряхивая пробирку, разбить осадок.
3.2.6. Результат оценить визуально. При отрицательном результате реакции осадок эритроцитов легко разбивается и образует гомогенную непрозрачную суспензию. При положительном результате осадок остается в виде одного или нескольких крупных агглютинатов на фоне прозрачной жидкости.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные Е+ и Е-эритроциты.
5. Хранение
Срок хранения Цоликлона анти-Е Супер - один год при температуре 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2-8°С в закрытом виде в течение одного месяца.
6. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, претензии к реагенту. Необходимо приложить протокол с результатами тестирования и 2- 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 15
Инструкция *(13)
по предупреждению посттрансфузионных осложнений,
обусловленных факторами Кеll и с(hr')
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Наиболее выраженным антигенными свойствами среди минорных антигенов эритроцитов обладают факторы Кеll(K) и с. Фактор K стоит на втором месте после антигена D в шкале трансфузионно опасных антигенов эритроцитов. Третье место занимает фактор с.
Индекс сенсибилизации (процент лиц с повышенным риском посттрансфузионного осложнения) к обоим указанным факторам высокий.
Фактор К встречается примерно у 10% людей, поэтому почти каждая десятая гемотрансфузия - это трансфузия К-положительной крови К-отрицательному реципиенту, каждая десятая беременность - это беременность К-отрицательной женщины К-положительным плодом.
С тем, чтобы избежать посттрансфузионных осложнений по фактору К, необходимо выдавать в лечебные учреждения Е-отрицательные эритроциты. В кабинетах, отделениях и станциях переливания крови следует производить определение К фактора у всех доноров в обязательном порядке наряду с определением групповой- и резуспринадлежности крови, после чего отбирать К-положительные образцы, не допуская их выдачи для переливания К-отрицательным больным.
К-положительным донорам целесообразно рекомендовать другой вид донорства (плазмы, тромбоцитов, лейкоцитов и др.), но не эритроцитов. Такие мероприятия позволят существенно снизить индекс сенсибилизации населения к фактору К, что в свою очередь будет способствовать предупреждению посттрансфузионных осложнений, обусловленных этим фактором, сократит частоту гемолитической болезни новорожденных.
Определение антигена К в эритроцитах производят с помощью следующих методов:
1. Непрямая проба Кумбса.
2. Желатиновый метод в пробирках.
3. Экспресс-метод на плоскости.
Индекс сенсибилизации населения к фактору с так же достаточно высок. Около 20% людей не содержат антигена с в эритроцитах. Именно эти люди представляют группу повышенного риска развития посттрансфузионного осложнения, поскольку им в 80% случаев переливают эритроциты, содержащие фактор с. Число переливаний с-положительных эритроцитов с-отрицательным реципиентам составляет 16 на 100 гемотрансфузий. Число беременностей с-положительным плодом с-отрицательных женщин составляет также 16 на 100.
С тем, чтобы уменьшить индекс сенсибилизации населения и избежать посттрансфузионных осложнений, обусловленных несовместимостью по этому фактору, целесообразно у каждого резус-положительного реципиента определять с-антиген и при его отсутствии переливать реципиенту кровь доноров с-отрицательных (гомозиготных по антигену С). На станциях и в отделениях переливания крови необходимо иметь резервную группу таких доноров или запас с-отрицательной эритроцитной массы.
Антиген с определяют теми же методами, что и антиген D.
Инструкция
по определению Келл-фактора экспресс-методом
Оснащение: специально приготовленные сыворотки анти-К универсальные, физиологический раствор NaCl, пластинки (тарелки) с гидрофильным покрытием, стеклянные палочки, песочные часы.
Для исследования используют свежие - не более 2-х дневного хранения, неотмытые или отмытые эритроциты, взятые со дна пробирки после отстаивания от сыворотки (третья фракция эритроцитов), плазмы с консервантом или физиологического раствора. Используют также цельную кровь, взятую из прокола пальца непосредственно перед исследованием.
Техника определения: на плоскость помещают одну каплю (0,05-0,06 мл)*(14) сыворотки анти-К и каплю эритроцитов в количестве 1/3 от объема взятой сыворотки. Капли перемешивают стеклянной палочкой и при плавном периодическом покачивании пластинки наблюдают за ходом реакции в течение 5 минут.
Оценка результатов: при положительном результате агглютинация эритроцитов появляется к 30 сек. - 1 мин. и в дальнейшем усиливается, при отрицательном результате агглютинация отсутствует. По истечении 3-4 минут в реагирующую смесь добавляют 1-2 капли физиологического раствора для снятия возможной неспецифической агрегации эритроцитов и продолжают наблюдение до истечения 5 минут, после чего регистрируют результат (см.рис.).
Положительный результат Отрицательный результат
Внимание! Во избежание ошибок рекомендуется использовать осадок
эритроцитов, максимально освобожденный от взвешивающей среды. Срок
годности сывороток - четыре месяца.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 16
Инструкция
по иммунизация доноров для получения сыворотки
и иммуноглобулина антирезус
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Выбор доноров для иммунизации
К иммунизации антигенами системы резус могут привлекаться доноры - мужчины от 18 до 50 лет и женщины от 45 до 50 лет или моложе, если у них уже наступила менопауза.
Реиммунизация может производиться лицам, ранее сенсибилизированным к антигену резус вследствие резус-конфликтных беременностей или введения им крови.
Иммунизацию и реиммунизацию проводят только после ознакомления с сущностью данной процедуры привлекаемых для этого лиц с их согласия, данного в письменной форме.
Перед иммунизацией и реиммунизацией доноры и сенсибилизираванные лица, привлеченные к донорству, проходят врачебное освидетельствование согласно "Инструкции по медицинскому освидетельствованию доноров крови, плазмы, клеток крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации 29 мая 1995 года.
Медицинское освидетельствование повторяется перед каждым курсом
иммунизации и реиммунизации. Наличие в анамнезе у женщин выкидышей,
мертворождений, гемолитической болезни у их новорожденных и другой
патологии, связанной с резус - конфликтом, не является противопоказанием
к иммунизации, реиммунизации и последующему взятию крови и плазмы
(плазмаферез). У этого контингента лиц допускается также содержание
гемоглобина не менее 120 г/л, количества эритроцитов - не менее
12 9
3,7х10 /л, лейкоцитов до 10х10 /л, палочкоядерных нейтрофилов до 10%,
лимфоцитов до 45%.
У лиц, давших согласие на иммунизацию и реиммунизацию, проводят исследования на антиген гепатита В, антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и на содержание аланинаминотрансферазы. Эти исследования повторяют перед каждым курсом иммунизации и реиммунизации.
К иммунизации допускаются лица, не содержащие в крови антигена гепатита В, антител к гепатиту С, вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ) и с содержанием аланинаминотрансферазы в пределах нормы.
Эритроциты лиц, отобранных для иммунизации, и доноров, кровь которых будет использована в качестве антигена, титруют по антигенам системы резус: D, С, Е, с, е и по возможности других систем (Келл, Даффи и т.д.).
До иммунизации сыворотку крови этих лиц проверяют на наличие различных форм резус - антител, а эритроциты - прямой пробой Кумбса. Положительный результат прямой пробы Кумбса является противопоказанием для иммунизации и реиммунизации, так же как и вообще для зачисления в доноры. При наличии резус-антител устанавливают специфичность и титр. Если эти показатели не дают возможности изготовления из этой крови стандартной сыворотки или иммуноглобулина антирезус, то для повышения активности антител такому лицу можно проводить реиммунизацию.
После иммунизации и реиммунизации донору должна быть выдана справка о том, какую кровь следует подбирать ему в случае необходимости гемотрансфузии.
Справка должна быть напечатана на картоне или плотной бумаге, отвечающей условиям длительного хранения, и помещена в прозрачный влагоустойчивый конверт. В справке должны быть указаны следующие сведения:
- город и название учреждения, производившего иммунизацию и выдавшего справку,
- фамилия, имя, отчество донора,
- группа крови по системе АВО;
- резус-принадлежность (фенотип);
- чем иммунизировали (резус-антиген);
- при необходимости гемотрансфузий обязателен индивидуальный подбор совместимой крови только от резус.............лиц.
Справка должна быть подписана руководителем учреждения с указанием даты и скреплена печатью.
2. Подготовка донора, кровь которого используется в качестве антигена
Антигеном для резус-иммунизации служат эритроциты консервированной крови активных доноров группы О(I) или одноименной с кровью иммунизируемого лица.
Помимо полного обследования, предусмотренного для доноров, дающих кровь для переливания больным, донор антигена должен быть обследован два раза в год у врача-инфекциониста с целью исключения латентно протекающего заболевания печени.
Для иммунизации применяется кровь, содержащая антиген, против которого предполагается получить антитела. Этот антиген должен отсутствовать у лица, которое иммунизируется этой кровью. Рекомендуется для каждой группы лиц (в количестве до десяти человек) использовать для иммунизации эритроциты одного и того же донора.
Кровь, используемая в качестве антигена, заготавливается стерильно в мелкой расфасовке на любом консервирующем растворе и годна к употреблению семь дней. После вскрытия флакона путем прокола пробки кровь должна быть использована сразу для иммунизации одного или нескольких доноров. Оставлять кровь после вскрытия флакона до прихода следующей группы доноров воспрещается. Для иммунизации могут быть использованы также криоконсервированные размороженные эритроциты со сроком хранения, предусмотренным для этой среды.
Для иммунизации рекомендуется отбирать эритроциты с высокой активностью соответствующих резус-антигенов. О ней судят по быстроте наступления и характеру агглютинации эритроцитов с антисывороткой соответствующей специфичности.
При иммунизации антигенами С и Е в течение курса рекомендуется для каждого иммунизируемого лица применять эритроциты одного и того же донора, преимущественно свежеконсервированные.
3. Условия иммунизации и реиммунизации
Инъекции антигена проводят в условиях соблюдения асептики, в специально отведенном помещении, в котором не производится работа с сыворотками. Помещение должно быть оборудовано бактерицидными лампами и проточной холодной и горячей водой. Перед иммунизацией проводят влажную обработку помещения с применением антисептиков. Для иммунизации применяют шприцы одноразового пользования, а при отсутствии - обычные шприцы, которые должны быть автоклавированы.
Перед началом и на 8-30 день после окончания каждого курса иммунизации у донора необходимо взять кровь для исследования на наличие, специфичность и активность антител.
Ниже приводятся схемы иммунизации и реиммунизации доноров антигенами системы резус. Однако при необходимости в этих схемах могут быть допущены некоторые отклонения в сроках введения антигена - до пяти дней между инъекциями и до полутора месяцев между курсами, и в дозах - в пределах +-5 мл.
При всех схемах иммунизации и реиммунизации кровь, используемая в качестве какого-либо антигена резус, должна быть отрицательной по фактору Келл.
4. Иммунизация доноров для получения антител анти-D
Для получения антител анти-D рекомендуется иммунизировать лиц фенотипа ссdddее, используя в качестве антигена эритроциты фенотипа ссDее. Однако следует иметь в виду, что в процессе такой иммунизации иногда, кроме антител анти-D, образуются антитела анти-С. Для избежания этого можно привлекать к иммунизации лиц фенотипа Ссddее, применяя в качестве антигена кровь фенотипа ссDее, а также фенотипа СсDее.
Иммунизация лиц гомозиготных по антигену С, т.е. фенотипа ССddее кровью вышеуказанных генотипов не разрешается ввиду возможности образования у них антител анти-с.
Схема иммунизации
Первый курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена в количестве: первая - 10 мл крови, последующие две инъекции - по 5 мл с интервалами между ними три - четыре дня. Через четыре месяца проводят второй курс иммунизации.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови донора-антигена по 5 мл на каждую с интервалами по три - четыре дня.
Третий и четвертый курсы: донорам, у которых за два курса не выработалось антител, через шесть месяцев после второго курса следует провести третий и четвертый курсы иммунизации, аналогичные второму курсу.
Если после четвертого курса у донора не выработается антител, через четыре месяца, и в дальнейшем с теми же интервалами следует провести сокрашенные курсы по типу реиммунизации.
Если и после такой длительной иммунизации антитела не образуются, донора от иммунизации отстраняют.
После выработки у донора активных антител, для сохранения и дальнейшего повышения их титра, им необходимо периодически проводить инъекции антигена - реиммунизацию.
5. Реиммунизания доноров для получения антител анти-D
Реиммунизация проводится лицам, у которых выработались антитела - D вследствие проведенной иммунизации, бывших ранее беременностей или переливания крови. Реиммунизация дает возможность сохранить титр антител в крови иммунизируемых лиц или добиться его повышения. Подбор крови-антигена для реиммунизации проводится так же, как и для иммунизации.
Реиммунизация проводится через четыре месяца после окончания иммунизации и появления антител и затем повторяется каждые четыре месяца. У лиц, иммунизированных беременностями или трансфузиями крови, реиммунизацию можно начать также не ранее, чем через четыре месяца, но только вне периода беременности и лактации.
Курс реиммунизации состоит из двух - трехкратного внутривенного или внутримышечного введения крови донора по 2-3 мл с интервалом два - три дня. Такие курсы повторяются каждые четыре месяца.
6. Время появления антител
Время появления неполных резус-антител анти-D колеблется от четырех месяцев до года и более лет от начала иммунизации. Титр антител может быть от 1:2 до 1:1024 и выше. Стойкие высокие титры анти-D у ранее не сенсибилизированных лиц обычно устанавливаются не ранее, чем через полтора года.
Приведенные схемы иммунизации и реиммунизации обеспечивают выработку неполных антител анти-D с титром не ниже 1:64 не менее чем у 70% иммунизируемых лиц.
7. Иммунизация доноров для получения антител анти-С и анти-Е
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуются следующие сочетания фенотипа крови иммунизируемого лица и эритроцитов, применяемых для иммунизации:
-----------------------T---------------------T--------------------------¬ ¦ Планируемые антитела ¦ Фенотип крови ¦Фенотип эритроцитов, при-¦ ¦ ¦ иммунизируемого лица¦меняемых для иммунизации¦ +----------------------+---------------------+--------------------------+ ¦ ¦ ccddee ¦ Ссddее CCddee ¦ ¦ +---------------------+--------------------------+ ¦ анти-С ¦ ccDee ¦ Ссddее CCddee ¦ ¦ ¦ ccDEe ¦ СсDее ССDее ¦ ¦ ¦ ¦ СсDЕе ССDЕе ¦ +----------------------+---------------------+--------------------------+ ¦ ¦ ссddее ¦ сcddEe ¦ ¦ ¦ Ссddее ¦ ¦ ¦ +---------------------+--------------------------+ ¦ анти-Е ¦ СсDее ¦ ссddЕе ссDЕЕ ¦ ¦ ¦ ¦ ссDЕе СсDЕЕ ¦ ¦ ¦ ¦ СсDЕе ¦ L----------------------+---------------------+---------------------------
Для получения антител анти-С и анти-Е рекомендуется две схемы иммунизации, из которых первая дает более благоприятный результат.
Первая схема иммунизации
Первый курс состоит из десяти внутривенных введений крови донора антигена с перерывом по два дня. Первые пять инъекций - по 2 мл и последующие пять - по 1 мл. Затем следует перерыв в четыре месяца.
Второй курс состоит из десяти внутривенных или внутримышечных введений крови с интервалами по два дня. Первые пять инъекций - по 1 мл и последующие пять - по 0,5 мл.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводят третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяют каждые четыре месяца.
Вторая схема иммунизации
Первый курс состоит из шести внутривенных или внутримышечных инъекций крови с интервалами по два - три дня. Первая инъекция - 10 мл и последующие пять - по 5 мл. Через восемь - десять месяцев проводится второй курс.
Второй курс состоит из трех внутривенных или внутримышечных инъекций крови по 5 мл с интервалами по три - четыре дня.
Третий и дальнейшие курсы. Если по окончании второго курса у донора не выработались антитела, выработались антитела с низким титром или титр их впоследствии ослабел, то через четыре месяца проводится третий курс иммунизации (реиммунизация), аналогичный второму, и так повторяется каждые четыре месяца.
8. Время появления антител анти-С и анти-Е
Антитела анти-С и анти-Е появляются в сроки от 6 месяцев (полные) до 2,5-3 лет (неполные) после начала иммунизации. Антитела появляются у 10-15% иммунизируемых лиц с титром 1:1 - 1:8 для неполных антител и 1:2 - 1:32 - для полных антител.
9. Заключение
Иммунизация и реиммунизация не оказывают отрицательного влияния на состояние здоровья доноров.
В процессе иммунизации, а также после выработки антител при взятии
крови и плазмы (плазмаферез) у доноров могут наблюдаться преходящие
изменения периферической крови, например, увеличение количества
палочкоядерных нейтрофилов до 10%, монотипов до 12%, лимфоцитов до 45%,
9
повышение содержания общего количества лейкоцитов до 10х10 /л, общего
биллирубина до 20,5 мкмоль/л, активности аланинаминотрансферазы до
1,36 мкмолей, пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 час
инкубации при 37°С. Эти сдвиги не являются противопоказаниями для
продолжения иммунизации и реиммунизации и взятия у доноров крови и плазмы
(плазмаферез).
Определение антител в сыворотке крови иммунизированных лиц, обработка сывороток и их испытание производится согласно действующей "Инструкции по изготовлению сывороток антирезус".
Оплата изоиммунным донорам за каждую иммунизацию производится по отдельному расчету согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Оплата изоиммунным донорам за дачу крови и плазмы (плазмаферез) производится в двукратном размере по отношению к неимунным донорам крови, плазмы согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
С целью увеличения количества изоимунных доноров крови, плазмы разрешается дополнительная оплата изоимунным донорам за дачу крови или плазмы на усмотрение органов управления здравоохранения субъектов Российской Федерации.
Изоимунные доноры имеют право на внеочередное обслуживание в лечебных учреждениях.
Методические рекомендации "Иммунизация доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/38 считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 17
Инструкция
по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами,
для приготовления стандартных эритроцитов
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Каждое учреждение службы крови, а также лаборатории в других лечебно - профилактических учреждениях, где производится определение резус-принадлежности и изготовление сывороток антирезус и других антисывороток должны иметь постоянных доноров, у которых берется кровь для приготовления стандартных эритроцитов.
Стандартные эритроциты применяют в обязательном порядке при определении группы крови АВО, резус-принадлежности, выявлении антиэритроцитарных антител, а также как контроль при изготовлении стандартных сывороток, предназначенных для определения группы крови АВО, сывороток антирезус, различных тест-сывороток для выявления антигенов эритроцитов.
1.1. при определении группы крови необходимо иметь контрольные эритроциты трех групп: О, А (подгруппа А1) и В,
1.2. при приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток следует использовать кровь доноров, указанных в пункте 1.1, и дополнительно иметь доноров подгруппы А2, А3, Ах, А2В, АВ2.
1.3. при определении резус-принадлежности необходимы контрольные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты.
1.4. при изготовлении стандартных сывороток антирезус и при
выявлении резус - антител необходимо иметь контрольные эритроциты
доноров, указанных в пункте в, и дополнительно подобрать доноров групп О,
А, В, АВ так, чтобы среди образцов крови было по одному
резус-положительному и одному резус-отрицательному образцу. Эти доноры
должны быть исследованы дополнительно и, в зависимости от наличия у них
различных антигенов резус, число доноров должно быть пополнено за счет
доноров группы О(I) так, чтобы в эритроцитах доноров этой группы
w
обязательно имелись антигены резус D, С, Е, с, е, С порознь или в
a b
различных сочетаниях, а также антигены систем К - k, Fу - Fу и других
систем эритроцитов.
1.5. при изготовлении тест-сывороток различной специфичности необходимо иметь контрольные эритроциты доноров, указанных в пунктах 1.3. и 1.4. и типированных по антигенам различных эритроцитарных систем: гомозиготные, гетерозиготные и отрицательные по различным антигенам.
2. Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут у доноров из пальца или из вены не чаще трех раз в неделю в зависимости от потребности.
3. Каждый донор, у которого берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, должен находиться на учете отделения донорских кадров, где на него должен быть заведен донорский журнал. Если лаборатория, для которой донор дает кровь малыми дозами, не входит в состав учреждения службы крови, донор находится на учете непосредственно в этой лаборатории.
При зачислении в доноры (в дальнейшем каждые четыре месяца) донор должен быть осмотрен врачом-терапевтом, у него проверяется содержание гемоглобина и число эритроцитов. Взятие крови допускается при условии содержания гемоглобина не ниже 12 г% (120 г/л) для женщин и 13 г% (130 г/л) - для мужчин.
4. В лабораториях, где у доноров берут кровь для приготовления стандартных эритроцитов, должна быть заведена книга учета взятия крови по следующей форме:
Фамилия___________________имя___________________отчество____________
Группа крови___________________________,
фенотип по различным системам эритроцитов___________________________
--------------T-------------T---------------T--------------T------------¬
¦ 1. Дата ¦1. Коли- ¦1. Расписка ¦1. Расписка ¦1. Расписка ¦
¦ взятия крови¦чество взятой¦донора, давшего¦лица, взявшего¦лица, испо- ¦
¦ ¦крови ¦кровь ¦кровь ¦льзовавшего ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦кровь для ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦работы ¦
+-------------+-------------+---------------+--------------+------------+
¦ 2. ¦ 2. ¦ 2. ¦ 2. ¦ 2. ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
5. Взятие крови количественно подытоживается за 1,5 - 2 месяца. Итог подписывается руководителем лаборатории или отдела, для нужд которого бралась кровь.
6. Руководитель лаборатории или отдела на основании записи в книге учета взятия крови дает донору справку, в которой должен указать количество взятой крови и за какой период времени взята кровь. Справку подписывает руководитель лаборатории или отдела.
7. Принимая во внимание многократность и характер процедуры взятия крови у доноров, компенсацию за взятую у них кровь устанавливают в тройном размере по сравнению с суммой компенсации, установленной для доноров, дающих кровь для переливания больным.
8. На доноров, у которых берут кровь малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов, распространяются все льготы, как для доноров, дающих кровь для переливания больным, согласно нормативным документам Министерства здравоохранения и органов управления здравоохранения субъектов Федерации. Выходной день предоставляется донору за суммарное взятие крови в количестве не менее 100 мл.
"Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами, для приготовления стандартных эритроцитов", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 14 октября 1976 года N 06-14/1, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 18
Инструкция
по определению иммунных антител групповой системы АВО
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
I. Введение
Антитела системы АВО - альфа и бета являются нормальными (естественными) у человека. Они относятся к полным антителам - агглютининам, хорошо реагируют в солевой среде, лучше выявляются при комнатной температуре и хуже при температуре 37°С. Добавление в реакцию коллоидных веществ не усиливает активности этих антител, непрямой пробой Кумбса их не выявляют.
Нормальные антитела альфа и бета легко абсорбируются из сыворотки при добавлении групповой субстанции Витебского. Они чувствительны к воздействию высокой температуры: прогревания при 70°С в течение десяти минут достаточно, чтобы эти антитела полностью потеряли активность.
Кроме нормальных (естественных) антител альфа и бета у человека могут появиться еще иммунные антитела этой системы, которые в отличие от нормальных были обозначены символами анти-А и анти-В.
Иммунные антитела не присутствуют регулярно в крови людей, но могут возникнуть вследствие изоиммунизации при парентеральном поступлении в организм несовместимого в групповом отношении антигена, при иногрупной беременности, при ошибочном переливании крови, несовместимой по системе АВО, а также при проведении некоторых прививок и иммунизации.
При иногрупной беременности, послужившей причиной гемолитической болезни плода, иммунные антитела анти-А или анти-В почти всегда присутствуют в крови матери к моменту рождения больного ребенка. При этом, им обычно сопутствует высокий титр нормальных антител альфа и бета.
При ошибочном переливании несовместимой крови иммунные антитела анти-А или анти-В появляются обычно на пятый - седьмой день, достигая максимума к пятнадцатому - двадцать пятому дню с последующим падением их титра.
В крови у таких больных одновременно повышается титр нормальных антител альфа и бета на 3-8 ступеней также с последующим снижением после 25-30 дня.
Иммунные антитела анти-А и анти-В могут быть как в полной так и неполной форме. Они активны при 37°С, могут иметь несколько более высокий титр при проведении реакции в коллоидной среде по сравнению с солевой и выявляться в непрямой пробе Кумбса. Иммунные антитела не абсорбируются при добавлении групповоспецифической субстанции Витебского. Они стойки к температурному воздействию и сохраняют активность при прогревании сыворотки в течение 10 минут при температуре 70°С, т.е. при условиях, при которых нормальные антитела альфа и бета полностью инактивируются. Выявление изоиммунных антител может служить ценным диагностическим признаком, в частности, при решении вопроса о причинах гемотрансфузионных осложнений и гемолитической болезни новорожденных. Эти исследования рекомендуются для использования в практике. Наиболее демонстративным отличием нормальных антител альфа и бета от иммунных антител анти-А и анти - В является их поведение при воздействии высокой температуры. На этих различиях и основано применение разных методов для выявления нормальных антител альфа и бета и изоиммунных антител анти-А и анти-В (см. разделы II-V). Активность иммунных антител проявляется в виде способности вызывать агтлютинацию эритроцитов при проведении реакции в солевой среде или, как конечный результат, в непрямой пробе Кумбса.
Кроме этих антител, вследствие иммунизации, вызванной теми же причинами, могут одновременно образоваться гемолизины, которым свойственна также групповая специфичность (Методы определения групповых гемолизинов см. в разделах II, VI).
II. Оснащение
При определении антител альфа, бета и иммунных антител анти-А, анти-В необходимо следующее оснащение:
- стандартные эритроциты группы А(II) и В(III) или смесь эритроцитов от 5-6 доноров отдельно каждой группы;
- стандартная сыворотка для пробы Кумбса;
- изотонический раствор NаСl;
- пробирки центрифужные;
- пробирки маленькие, высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 5-6 мм и с гладким дном округлой формы;
- пробирки высотой 4-10 см для пробы Кумбса;
- белые пластинки со смачиваемой поверхностью;
- штативы;
- термостат 37°С;
- центрифуга;
- водяная баня 70°С.
III. Определение полных иммунных антител системы АВО
реакцией солевой агглютинации
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и B(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl путем центрифугирования, после чего на дне пробирки остается эритроцитная масса, из которой приготавливают 2-3% взвеси и отдельно каждой группы.
Исследуемую сыворотку в количестве 0,5-1 мл разводят в четыре раза изотоническим раствором NаCl во избежание коагуляции при нагревании, затем разливают поровну в две пробирки, одну из которых прогревают в течение 10 минут при 70°С, точно соблюдая температуру и время. Таким образом, получится две порции сыворотки - нативной и прогретой, каждая из которых разведена 1:4.
Определение антител начинается реакцией агглютинации в солевой среде в маленьких пробирках. Если в этом методе полных иммунных антител не обнаружено, исследование далее дополняют непрямой пробой Кумбса.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают в ряд 12 маленьких пробирок. При исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 12 пробирок. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверствия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и у каждой пробирки - степень разведения помещенной в нее сыворотки (1:4, 1:8, 1:16 и т.д. до 1:8000).
Во все пробирки каждого ряда, начиная со второй, накапывают по две капли изотонического раствора NаСl. Затем в первую и во вторую пробирки (каждого ряда) накапывают по две капли приготовленной непрогретой сыворотки, разведенной в четыре раза.
Во второй пробирке каждого ряда сыворотку смешивают с изотоническим раствором NаСl и две капли этой смеси переносят в третью пробирку, из третьей, также после перемешивания - в четвертую и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получается разведение сыворотки от 1:4 до 1:8000.
В другом штативе также приготавливают разведения предварительно прогретой сыворотки (при этом в штатив обычно достаточно поместить по шесть пробирок - разведение сыворотки от 1:4 до 1:128).
После приготовления разведений сыворотки во все пробирки добавляют по одной капле 2-3 % взвеси стандартных эритроцитов противоположной группы: при исследовании сыворотки группы В(III) - эритроциты группы А(II), при исследовании сыворотки группы А(II) - эритроциты группы В(III) и при исследовании сыворотки группы O(I) в один ряд пробирок добавляют эритроциты группы А(II), в другой ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают, после чего штативы оставляют в покое на 1 час: с нативной сывороткой при комнатной температуре, с прогретой - при 37°С.
3. Трактовка результатов
Результат оценивают по форме осадка эритроцитов на дне пробирки, просматривая его через лупу с 6-8-кратным увеличением над источником света.
При наличии агглютинации осадок располагается в виде комочков неравномерным слоем с изогнутыми, иногда завернутыми внутрь краями. При отсутствии агглютинации осадок эритроцитов располагается равномерным слоем в центре дна пробирки в виде правильно очерченного круга. Результаты отмечают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) или минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии полных антител, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре.
Титр антител нативной (непрогретой) сыворотки относится к агглютининам альфа (или бета), титр антител в прогретой сыворотке - к иммунным антителам анти-А (или анти-В). В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицатьный результат во всех пробирках с прогретой сывороткой говорит об отсутствии иммунных антител полной формы.
IV. Определение неполных изоиммунных антител системы АВО
непрямой пробой Кумбса
1. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты или смеси эритроцитов группы А(II) и В(III) дважды отмывают изотоническим раствором NаСl, после чего на дне пробирок остаются эритроциты, которые используют для исследования.
2. Техника реакции
При исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) в штатив устанавливают 6 пробирок, при исследовании сыворотки группы О(I) - два ряда по 6 пробирок. Пробирки нумеруют. Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге делают обозначения, указав у каждой пробирки ее номер и все другие сведения, как сказано выше для реакции солевой агглютинации.
Во все пробирки, начиная с N 2, накапывают по три капли изотонического раствора NаСl, а затем в пробирки N 1 и N 2 - по три капли исследуемой, предварительно прогретой сыворотки и далее приготавливают ее разведения, как это указано выше для метода солевой агглютинации, но в объеме трех капель.
Во все пробирки пастеровской пипеткой добавляют по одной маленькой капле (0,01 мл) эритроцитов противоположной группы, смешивают сыворотку с эритроцитами и штатив помешают для инкубации в термостат на 45 минут при 37 °С. За это время иммунные антитела, если они есть в сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
После инкубации отмывают эритроциты, для чего в пробирки доливают изотонический раствор NаСl, перемешивают их содержимое и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют. Такое отмывание повторяют три раза.
После отмывания в каждую пробирку добавляют 3-5 капель изотонического раствора NаСl для получения приблизительно 5% взвеси эритроцитов и из каждой пробирки по одной капле такой взвеси переносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью, пронумеровав предварительно места на пластинке соответственно номерам пробирок. К каждой капле прибавляют по одной капле сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают их стеклянной палочкой. Далее в течение 10 минут наблюдают результат при периодическом покачивании пластинки.
Результат оценивают по наличию или отсутствию агглютинации, видимой простым глазом на белом фоне пластинки. Наступление агглютинации обозначают на бумаге у каждой пробирки знаком плюс (+) с указанием времени ее появления в секундах и минутах. Отсутствие агглютинации обозначают знаком минус (-).
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии иммунных антител анти-А или анти-В неполной формы, а последнее разведение, в котором оно наблюдается - об их титре *(15).
В том случае, если агглютинация наблюдается во всех пробирках, следует повторить исследование, продолжив разведение сыворотки.
Отрицательный результат во всех пробирках свидетельствует об отсутствии иммунных антител неполной формы в данной порции исследуемой сыворотки.
3. Трактовка результатов
В ходе вышеописанного исследования определяются три вида антител:
- нормальные полные антитела - агглютинины альфа и бета (термолабильные);
- иммунные полные антитела анти-А и анти-В (термостабильные),
- иммунные неполные антитела анти-А и анти-В (термостабильные).
Общее заключение делается на основании сопоставления результатов всех исследований:
а) наличие иммунных (термостабильных) антител полной или неполной формы свидетельствует об имевшем место поступлении в организм человека антигена, несовместных полных (термолабильных) антител альфа и бета и редко превышает такие показатели, как 1:8 - для иммунных полных антител и 1:32 - для иммунных неполных антител;
б) высокий титр нормальных полных антител - агглютининов альфа и бета (альфа выше, чем 1:256 и бета выше, чем 1:128 при данном методе исследования) даже при отсутствии иммунных термостабильных антител в момент исследования, отражает состояние повышенной сенсибилизации организма и позволяет сделать предположение о бывшем в предшествующее время поступлении антигена, несовместимого по системе АВО.
в) отсутствие иммунных термостабильных антител анти-А и анти-В при титре нормальных антител альфа не выше, чем 1:256 и бета не выше, чем 1:128 (при данном методе исследования) говорит об отсутствии у человека изоиммунизации групповыми факторами системы АВО к моменту данного исследования.
V. Определение гемолизинов системы АВО
1. Оснащение
- стандартные эритроциты группы О(I), А (II) и В(III)
- изотонический раствор NаСl
- пробирки вместимостью 8-10 мл
- маленькие пробирки высотой 4-5 см, диаметром 0,8-1,0 см
- штативы
- термостат 37°С
- центрифуга
2. Подготовительная работа
Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III), а также эритроциты исследуемого лица дважды отмывают изотоничеcким раствором NаСl путем центрифугирования и готовят из них 5% взвесь в изотоническом растворе NаСl.
Сыворотку для исследования используют со сроком хранения не более 48 часов при температуре 4-8°С.
В предварительно пронумерованных пяти пробирках вместимостью 8-10 мл готовят разведения исследуемой сыворотки в изотоническом растворе NаСl, начиная от 1:2 до 1:32 в объемах 2-3 мл.
3. Техника реакции
В штатив устанавливают по пять маленьких пробирок: три ряда при исследовании сыворотки группы А(II) или В(III) или четыре ряда - при исследовании сыворотки группы О(I). Пробирки нумеруют одинаково во всех рядах соответственно нумерации пробирок с исходными разведениями сыворотки.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по пять капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т. д. до 1:32.
Штатив предварительно накрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия для установки пробирок. На бумаге надписывают фамилию и группу крови лица, чья сыворотка исследуется, группу крови стандартных эритроцитов и степень разведения помещенной в пробирках сыворотки (1:2 - 1:32).
Исследуемую сыворотку из исходных разведений переносят соответственно номерам по 5 капель в маленькие пробирки так, чтобы во всех первых номерах было разведение 1:2, во вторых - 1:4 и т.д. до 1:32.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле 5 % взвеси эритроцитов: в первый (контрольный) ряд пробирок вводят эритроциты лица, сыворотка которого исследуется: во второй (также контрольный) ряд - эритроциты группы О(I); в третий ряд вводят эритроциты противоположной группы, т.е. группы В(III), если исследуется сыворотка группы А(II) или группы А(II), если исследуется сыворотка группы В(III). При исследовании сыворотки группы О(I) в третий ряд вводят эритроциты группы А(II), а в четвертый ряд - эритроциты группы В(III).
Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и штатив помещают на 45 минут при температуре 37°С, затем пробирки вынимают из термостата и рассматривают результат невооруженным глазом в проходящем свете.
4.Трактовка результатов определения групповых гемолизинов
В ходе исследования определяется наличие или отсутствие групповых гемолизинов анти-А и анти-В.
Результаты оценивают по соотношению количества сохранившихся эритроцитов в осадке и степени гемолиза, т.е. интенсивности окрашивания надосадочной жидкости:
- если эритроциты полностью сохранились в осадке, а надосадочная жидкость прозрачна и бесцветна, это значит, групповые гемолизины отсутствуют, что обозначают знаком минус (-),
- если осадок эритроцитов частично сохранился, а надосадочкая жидкость прозрачна и окрашена в красный цвет разной интенсивности (иногда только небольшим слоем над осадком эритроцитов) - это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины различной степени активности (обозначают знаками от одного плюса (+) до трех плюсов (+++),
- если осадок эритроцитов отсутствует, а вся жидкость окрашена в ярко-красный цвет и прозрачна, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся групповые гемолизины, что оценивается на четыре плюса (++++), ...
Методические рекомендации "Определение иммунных антител групповой системы АВО", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября 1990 года N 10-11/135, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 19
Инструкция
по изготовлению консервированных стандартных эритроцитов
и их применению в изосерологических исследованиях
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Стандартные эритроциты, содержащие определенные сочетания
аллоантигенов, предназначены для выявления антиэритроцитарных антител в
сыворотке исследуемой крови, при определении групп крови АВО
перекрестным способом, при определении резус - принадлежности крови, а
также для проведения контроля специфичности и активности стандартных
изогемагглютинирующих сывороток АВО, сывороток антирезус; тест-сывороток
и реактивов, предназначенных для определения антигенов различных систем
эритроцитов крови человека. Стандартные эритроциты группы О(I) должны
w
содержать в эритроцитах клинически значимые антигены: D, С, С , с, Е, е,
К, k, Fу, Jk, М, N, S, s, Le.
С целью увеличения срока годности стандартных эритроцитов можно производить их консервирование специально изготовленными консервирующими растворами.
I. Требования, предъявляемые к стандартным эритроцитам
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6