Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2 "Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года
Страница 4
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это значит, что исследуемая кровь резус - положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутствует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
Однако результат учитывают как истинный только при отсутствии агглютинации в контроле.
При наличии агглютинации в контроле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, кровь необходимо исследовать повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.
3. Изготовление универсальной сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином для определения резус-принадлежности
на плоскости без подогрева
Сыворотка антирезус содержит неполные антитела анти-D. Выпускается в комплекте с контрольной сывороткой, не содержащей резус-антител. Сыворотка предназначена для определения резус-антигена D.
Материалом для изтотовления сыворотки антирезус в сочетании с альбумином служит сыворотка крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленная - универсальная с титром неполных резус-антител анти-D не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых агглютининов альфа и бета.
Контрольная сыворотка должна соответствовать требованиям, предъявляемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении сывороток антирезус в сочетании с альбумином необходимы:
- альбумин 20-30 % раствор, полученный из плазмы крови человека;
- образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови, взятой на гепарине;
- гепарин;
- изотонический раствор NаСl.
Работу по изготовлению сыворотки начинают с подбора оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина. Подбор можно вести двумя способами:
а) используя одну и ту же сыворотку антирезус, испытывая с ней разные образцы (серии) альбумина, и выбирая таким образом образец альбумина с высокой конглютинационной активностью;
б) используя один и тот же образец (серию) альбумина, испытывая его с разными образцами сыворотки антирезус.
Выбор альбумина с высокой конглютинационной активностью
Сыворотку антирезус с титром неполных антител 1:64 - 1:128 разводят в пробирках в 2-4 раза отдельно различными образцами раствора альбумина.
Разные смеси сыворотки антирезус с альбумином исследуют на пластинке с 5-6 образцами Rh+ и с 5-6 образцами крови ссddeе, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEе.
Cыворотку антирезус, смешанную с альбумином, переносят в 2 точки по 2 капли (0,1 мл) на пластинку, добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают и размазывают по пластинке до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до истечения 5 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результата.
Результат учитывают по скорости наступления и величине агглютинатов резус-положительных эритроцитов и отсутствии агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами. На основании этого отбирают образwы альбумина, наиболее пригодные для использования.
Для последующего использования применяют образцы альбумина, при испытании которых агглютинация резус-положительных эритроцитов появляется в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая аггрегация резус-отрицательных эритроцитов отсутствует до истечения 10 минут.
Подбор сыворотки антирезус с высокой конглютинационной
активностью в альбуминовой среде
Несколько различных образцов сыворотки антирезус наносят отдельно в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку и добавляют к ним по капле (0,05 мл) 20-30% альбумина.
Сыворотку тщательно смешивают с альбумином и добавляют к ней по 1 капле (0,05 мл) резус-положительной и резус-отрицательной крови. Капли перемешивают с эритроцитами на плоскости до получения тонкого слоя. Наблюдение ведут до 5 минут при покачивании пластинки.
Так поступают отдельно для каждого испытуемого образца сыворотки, испытывая их с 5-6 образцами Rh+ крови и с 5-6 образцами крови ссddее, а также с кровью фенотипа Ссddее и сcddEe.
Учет и оценка результата
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и по отсутствию с резус-отрицательными эритроцитами ссddее и эритроцитами генотипа Ссddее и ссddЕе.
Для последующего использования выбирают сыворотки антирезус анти-D, при испытании которых четко выраженная агглютинация резус - положительных эритроцитов наступает в течение первых 20-30 секунд, а неспецифическая агглютинация резус-отрицательных эритроцитов фенотипа Ccddee и ccddEe отсутствует до истечения 10 минут.
Подбор оптимального соотношения сыворотки антирезус и альбумина
После выбора альбумина с наиболее высокой коглютинирующей способностью или, наоборот, выбора сыворотки антирезус с высокой агглютинирующей активностью в альбуминовой среде, приступают к подбору оптимального их соотношения, для чего:
в штатив устанавливают 5 пронумерованных пробирок;
в первую пробирку вносят 2 капли (0,1 мл) выбранной серии альбумина, во вторую пробирку - 4 капли, в третью - 6, в четвертую - 8 и в пятую - 10 капель;
в каждую пробирку добавляют по 2 капли (0,1 мл) сыворотки антирезус и содержимое тщательно перемешивают;
из каждой пробирки переносят в 2 точки по 1 капле (0,05 мл) на пластинку, образуя таким образом 2 ряда сыворотки с альбумином;
во все капли первого ряда вносят по 1 капле (0,05 мл) свежей резус-положительной крови, во 2-ой - резус-отрицательной крови (кровь предварительно берут с гепарином - 1 капля на 10 мл крови). Смесь перемешивают и ведут наблюдение в течение 3 минут при покачивании пластинки.
Учет и оценка результатов
Четкая аглютинация Rh-эритроцитов и отсутствие аглютинации rhэритроцитов ccddee и эритроцитов фенотипа Ссddee и ccddEe указывает на оптимальное соотношение данного образца сыворотки антирезус и альбумина.
Приготовление основного объема (серии) сыворотки антирезус анти-D
в сочетании с альбумином
Для приготовления полного объема (серии) стандартной сыворотки используют выбранные оптимальные соотношения сыворотки и альбумина. И сыворотку и альбумин используют тех же серий, которые применялись для установления оптимального их соотношения.
К изготовленному полному объему смеси сыворотки с альбумином добавляют гепарин из расчета - 1 капля на 20 мл сывортки.
Приготовленную таким образом сыворотку проверяют на пластинках с 5-6 образцами резус-положительных эритроцитов и с 5-6 образцами резус-отрицательных ccddee , а также с эритроцитами фенотипа Ccddee и ccddEe.
При наличии четко выраженной агглютинации с резус-положительной кровью, наступающей через 30-40 сек, и отрицательной реакции с резус - отрицательной кровью ссddee и кровью фенотипа Ссddee и ссddЕe, сыворотку антирезус в сочетании с альбумином считают пригодной в качестве стандартной сыворотки анти-D для определения резус - принадлежности на плоскости без подогрева.
Исследование проводят с одновременным параллельным использованием контрольной сыворотки.
Изготовление контрольной сыворотки
Для изготовления контрольной сыворотки используют изогемагглютинирующую сыворотку группы АВ(IV) и добавляют к ней альбумин того же образца (серии) и в том же количестве и в соотношении, которые были использованы для приготовления данной серии сыворотки антирезус.
Контрольную сыворотку испытывают аналогично тому, как описано выше для сыворотки антирезус. Контрольная сыворотка не должна вызывать агглютинацию эритроцитов.
Консервирование сыворотки
Сыворотку антирезус и контрольную сыворотку консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл сыворотки.
Розлив и паспортизация сыворотки антирезус и контрольной сыворотки
Сыворотку антирезус разливают по 1-2 мл в ампулы, которые запаивают, или во флаконы, которые плотно укупоривают резиновыми пробками. На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего сыворотку, специфичности сыворотки, метода, для которого она предназначена, количества, номера серии и срока годности.
Контрольную сыворотку разливают, в таких же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и так же наклеивают этикетки. Номер серии контрольной сыворотки повторяет номер серии основной сыворотки антирезус.
Хранение, срок годности и контроль
Сыворотки антирезус, изготовленные в сочетании с альбумином, и контрольные сыворотки хранят при 4-8°С.
Срок годности - 4 месяца.
По истечении срока годности, но при сохранении активности и специфичности сывороток, срок годности может быть продлен еще на 1 месяц.
Выдача сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус выдается в комплекте с контрольной сывороткой.
К каждому комплекту прилагают инструкцию по использованию.
-------------------------------¬ -------------------------------¬
¦ Наименование учреждения ¦ ¦ Наименование учреждения ¦
¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦
+------------------------------+ +------------------------------+
¦ Сыворотка антирезус-D ¦ ¦ Контрольная сыворотка ¦
¦ для метода на плоскости ¦ ¦ для метода на плоскости ¦
¦ без подогрева ¦ ¦ без подогрева ¦
¦ Для всех групп крови ¦ ¦ Для всех групп крови ¦
¦ системы АВО ¦ ¦ системы АВО ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦ Серия__________ мл______ ¦ ¦ Серия__________ мл______ ¦
¦ Годна до________________ ¦ ¦ Годна до________________ ¦
L------------------------------- L-------------------------------
Формы этикеток для сыворотки антирезус и контрольной сыворотки.
4. Изготовление реактива антирезус с использованием сухого
полиглюкина для определения резус принадлежности
на плоскости без подогрева
Реактив содержит неполные активные антитела антирезус анти-D, представляет собой вязкий опалесцирующий мутноватый раствор. При хранении может выпадать осадок. Выпускается в комплекте с контрольным реактивом, не содержащим резус-антител.
Материалом для изготовления реактива антирезус служат нативные сыворотки крови людей группы АВ(IV) или специально приготовленные - универсальные с титром неполных резус-антител не ниже 1:64 - 1:128 в непрямой пробе Кумбса. Сыворотка должна быть предварительно исследована и признана годной, как стандартная сыворотка антирезус.
Материалом для изготовления контрольной сыворотки служит сыворотка крови людей группы АВ(IV), т.е. не содержащая как резус-антител, так и групповых антител альфа и бета. Контрольная сыворотка должна ... тов.
Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на 3 минуты, периодически покачивая пластинку; через 3 минуты во все капли добавляют по 5-6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через 2 минуты учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddeе и ссddЕе.
Учет и оценка результатов
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус-отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddеe и rccddEe.
Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddee) и эритроцитами фенотипа СсddEe и ссddEe.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.
Соответствовать требованиям, предъявлаемым к стандартным изогемагглютинирующим сывороткам системы АВО.
При изготовлении реактива антирезус необходимы:
полиглюкин, высушенный лиофильным способом;
альбумин - 2,5% раствор;
изотонический раствор NаСl;
образцы резус-положительной и резус-отрицательной крови.
Примечания:
1. Полиглюкин высушивают лиофильным способом на сублимационном аппарате по регламенту, установленному для сушки плазмы. Сушку ведут во флаконах емкостью 250-500 мл.
2. 2,5% раствор альбумина получают из готового 10%-20% раствора альбумина путем разведения его изотоническим раствором NаСl.
Изготовление реактива антирезус
Сыворотку, содержащую антитела анти-D с титром не ниже чем 1:64 - 1:128*(8), переносят во флакон с предварительно высушенным полиглюкином в объеме, равном количеству жидкого полиглюкина, высушенного в данном флаконе. В результате конечная концентрация полиглюкина составит 6%.
Содержимое флакона тщательно перемешивают путем встряхивания до полного растворения порошка полиглюкина.
Изготовление контрольного реактива.
Для изготовления контрольного реактива в другой такой же флакон с высушенным полиглюкином той же серии добавляют стандартный разводитель или 2,5% раствор альбумина так же до исходного объема полиглюкина. Содержимое тщательно перемешивают до полного растворения порошка полиглюкина.
Исследование качества изготовленных реактивов.
Исследование реактивов производят непосредственно после их изготовления с резус-положительными и резус-отрицательными эритроцитами и оценивают по характеру агглютинации и специфичности реакции:
на пластинку помещают два ряда, слева - по две капли (0,1 мл) реактива антирезус и справа - по две капли (0,1 мл) контрольного реактива;
в первый ряд добавляют по одной капле (0,05 мл) резус - положительных эритроцитов, во второй ряд также по одной капле резус - отрицательных эритроцитов. Содержимое капель перемешивают, затем размазывают до получения тонкого слоя и оставляют на три минуты, периодически покачивая пластинку;
через три минуты во все капли добавляют по 5-6 капель изотонического раствора NаСl, перемешивают и через две минуты учитывают результат.
Реактивы исследуют не менее чем с 20 образцами резус-положительных и с 30 образцами резус-отрицательных эритроцитов групп А(II), АВ(IV) и В(III), включая эритроциты Ссddее и ссddEе.
Учет и оценка результатов
Результат учитывают по скорости наступления агглютинации и ее выраженности с резус-положительными эритроцитами и отсутствием ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа Ссddее и rccddЕе.
Показателем пригодности реактива для последующего использования является наличие крупно-зернистой агглютинации резус-положительных эритроцитов со скоростью наступления до 1 минуты и отсутствие ее с резус - отрицательными эритроцитами (ссddее) и эритроцитами фенотипа СсddЕе и ссddЕе.
Контрольный реагент исследуется так же как описано выше для реагента антирезус. Агглютинация с контрольным реагентом должна отсутствовать со всеми образцами эритроцитов.
Консервирование реактивов
Реактив антирезус и контрольный реактив консервируют борной кислотой из расчета 2 гр. на 100 мл реагента.
Розлив и паспортизация
Реагент антирезус разливают во флаконы или ампулы. Ампулы запаивают, флаконы плотно укупоривают резиновыми пробками и завальцовывают или парафинируют.
На ампулы, флаконы наклеивают этикетки с указанием учреждения, изготовившего реактив, специфичности реактива, метода для которого он предназначен, количества, номера серии и срока годности.
Контрольный реактив разливают в такие же объемах и в том же количестве ампул (флаконов) и также наклеивают этикетки с соответствующим текстом. Номер серии контрольного реактива повторяет номер серии основного реактива антирезус.
----------------------------¬ ----------------------------¬
¦ Наименование учреждения ¦ ¦ Наименование учреждения ¦
¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦
+---------------------------+ +---------------------------+
¦ Реактив антирезус - D ¦ ¦ Контрольный реактив ¦
¦ для метода на плоскости ¦ ¦ для метода на плоскости ¦
¦ без подогрева ¦ ¦ без подогрева ¦
¦ Серия_________ мл______ ¦ ¦ Серия_________ мл______ ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦ Годен до_______________ ¦ ¦ Годен до_______________ ¦
L---------------------------- L----------------------------
Формы этикеток для реактива антирезус и контрольного реактива
Хранение, срок годности и контроль
Реактив антирезус, приготовленный с сухим полиглюкином и контрольный реактив хранят при 4-8°С. Срок годности 4 месяца.
Реактив антирезус и контрольный реактив проверяют на активность и специфичность через месяц.
Выдача реактива антирезус
Реактив антирезус выдается, в комплекте с контрольным реактивом.
К каждому комплекту (или набору комплектов) придается инструкция по использованию.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус, предназначенных для этой цели", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 6 декабря 1990 года N 05-14/38-14 считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 9
Инструкция *(9)
по применению Цоликлона анти-В диагностического жидкого
для определения D антигена системы резус
(Антитела моноклональные анти-D) ТУ 9398-215-27575295-95
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Назначение
Цоликлона анти-D предназначен для выявления D антигена системы резус в эритроцитах человека и применяется в серологических тестах взамен или параллельно с изоиммунной анти-D сывороткой.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус-принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона Анти-D
Действующим началом Цоликлона Анти-D являются моноклональные анти-D антитела, продуцируемые лимфобластонаной линией клеток человека, полученной из лимфоцитов донора, гипериммунного против D антигена. Антитела, продуцируемые клетками одного клона, являются моноклональными, принадлежат к одному классу иммуноглобулинов, полностью идентичны по структуре и биологической активности.
Поскольку линия клеток, секретирующих моноклональные анти-D антитела, получена из лимфоцитов здорового донора, исключена контаминация реагента патогенными вирусами (гепатит, СПИД и др.). Однако с исследуемыми образцами крови следует работать в перчатках во избежание заражения патогенными вирусами, передающимися через кровь.
Цоликлон анти-D представляет собой неразбавленную или разведенную солевым раствором культуральную жидкость, кондиционированную клетками - продуцентами антител. Анти-D моноклональные антитела принадлежат к иммуноглобулинам класса G (IgGl). Цоликлон Анти-D не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.
Анти-D антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G (неполные антитела), не вызывают прямой агглютинации эритроцитов, содержащих D антиген, и могут быть использованы в реакции конглютинации с желатином, непрямом антиглобулиновом тесте (пробе Кумбса), в реакции агглютинации эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, в том числе в автоматизированных системах типа "Группоматик".
3. Техника определения D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной с помощью применяемых консервантов, в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов. Заключение о присутствии D-антигена в исследуемых эритроцитах делают по наличию положительной реакции агглютинации.
3.1. Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса)
Является наиболее чувствительным методом выявления D антигена. Взвесь (2-3%) в физиологическом растворе трижды отмытых исследуемых эритроцитов помещают в круглодонную пробирку (0,1 мл взвеси эритроцитов) или 96-ячеечную круглодонную плату (0,05 мл/ячейку), добавляют равный объем Цоликлона и инкубируют в течение 45-60 минут при 37°С. Затем после однократного отмывания физиологическим раствором к осадку эритроцитов добавляют 0,05-0,1 мл антиглобулиновой сыворотки, тщательно перемешивают и немедленно или через 15-30 минут инкубации при комнатной температуре центрифугируют при 200 g в течение 35-20 секунд. Осадок мягко взвешивают и по наличию агглютинатов, выявляемых макро- или микроскопически, делают заключение о присутствии D антигена в исследуемых эритроцитах.
3.2. Реакция конглютинации с желатином
В агглютинационную пробирку вносят одну каплю (0,05-0,1 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта. Затем добавляют две капли (0,3-0,2 мл) 10% раствора желатина, предварительно прогретого при 45-50°С до разжижения, и одну каплю Цоликлона Анти-D. Суспензию тщательно перемешивают, инкубируют 10-15 минут в водяной бане или 30 минут в термостате при 48°С, прибавляют 5-6 мл физиологического раствора и после осторожного переворачивания пробирки визуально определяют наличие агглютинатов. Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них D антигена.
3.3 Реакция с препаратом на основе полиглюкина
Полиглюкин практически всегда вызывает неспецифическую агглютинацию D-отрицательных эритроцитов, поэтому невозможно объективное заключение об отсутствии D антигена или о наличии его слабого варианта в исследуемых эритроцитах. В связи с этим использование полиглюкина для моноклональных антител не рекомендуется.
3.4. Реакция агглютинации с эритроцитами, обработанными
протеолитическими ферментами
Цоликлон Анти-D, содержащий моноклональные антитела класса lgG, способен вызывать прямую агглютинацию D-положительных эритроцитов, обработанных такими протеолитическими ферментами как бромелин, папаин и др., и поэтому может применяться в автоматических системах типирования крови.
3.5. Контроль специфичности реакции агглютинации
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики исследования) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты. Желательно также включение образцов со слабовыраженным D антигеном.
4. Форма выпуска
Цоликлон Анти-D выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цоликлона анти-D диагностического жидкого для определения D антигена системы резус (Антитела моноклональные анти-D)", утвержденную Главным техническим Управлением Минздрава СССР 21 августа 1990 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 10
Инструкция *(10)
по применению анти-D IgM моноклонального реагента
для определения резус-принадлежности крови человека
(Цоликлона анти-D Супер) ТУ 9398-206-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Назначение
Цоликлон анти-D Супер предназначен для выявления антигена D системы резус в эритроцитах человека.
Порядок установления резус-принадлежности крови определен "Инструкцией по определению резус-принадлежности крови", утвержденной Министерством здравоохранения Российской Федерации в 1997 году и Методическими рекомендациями по определению резус-принадлежности крови, утвержденными ГНЦ РАМН 27 апреля 1994 года.
В связи с тем, что IgM антитела не вызывают агглютинации некоторых
u
образцов эритроцитов со слабовыраженным D антигеном (D ), образцы
донорской крови, которые при исследовании Цоликлоном анти-D Супер были
определены как D-отрицательные, необходимо дополнительно тестировать с
помощью анти-D реагентов, содержащих lgG-антитела (поликлональной
сывороткой или моноклональным анти-D lgG реагентом).
2. Характеристика и основные свойства Цоликлона Анти-D Супер
Действующим началом Цоликлон Анти-D Супер являются моноклональные анти-D антитела, которые продуцируются гетерогибридомой, полученной в результате слияния человеческой лимфобластоидной линии с миеломной клеточной линией мыши.
Цоликлон Анти-D Супер изготовлен на основе культуральной жидкости, кондиционированной клетками-продуцентами антител Анти-D. Реагент не содержит антител иной специфичности и поэтому может быть использован для выявления D антигена в эритроцитах любой группы крови.
Моноклональные антитела принадлежат к одному классу иммуноглобулинов - IgM, полностью идентичны по структуре и биологической активности. Анти-D антитела класса М являются полными антителами, т.е. вызывают прямую агглютинацию эритроцитов, содержащих D антиген. Цоликлон Анти-D Супер может быть использован для выявления D антигена в любых вариантах прямой реакции агглютинации: на плоскости, в пробирках, в микроплате.
3. Определение D-антигена системы резус
Определение D-антигена производится в нативной крови, стабилизированной консервантом; в крови, взятой без консерванта; в крови, взятой из пальца.
3.1. Реакция агглютинации на плоскости
На пластину со смачиваемой поверхностью нанесите большую каплю (около 0,1 мл) реагента. Рядом поместите маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешайте кровь с реагентом. Наиболее крупная агглютиниция наблюдается при использовании эритроцитов в высокой концентрации. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 секунд, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 секунд. Использование подогретой до 37-40°С пластинки сокращает время наступления агглютинации. Результаты реакции учитывайте через три минуты. Пластинку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 секунд, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.
3.2. Реакция агглютинации в пробирках
В круглодонную пробирку внесите одну каплю (около 0,1 мл) реагента и добавьте одну каплю 5% суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе. Содержимое пробирки тщательно перемешайте встряхиванием и инкубируйте 30 минут при комнатной температуре. После инкубации пробирку центрифугируйте при 1500-2000 оборотах в минуту в течение одной минуты. Мягко покачивая пробирку, отслоите осадок ото дна. При отрицательном результате осадок эритроцитов разбивается, образуя непрозрачную гомогенную суспензию. При положительном результате в пробирке видны агглютинаты на фоне прозрачной жидкости.
3.3 Реакции агглютинации в микроплате
В лунку 96-ячеечной круглодонной микроплаты внесите 0,05 мл реагента и 0,05 мл 2% суспензии исследуемых эритроцитов в физиологическом растворе (эритроциты предварительно дважды отмойте). Через 45-60 минут инкубации при комнатной температуре визуально оцените результат реакции по рисунку осадка эритроцитов на дне лунки: при отрицательном результате осадок эритроцитов собирается в точку, при положительном - имеет больший диаметр, располагается неравномерным слоем, имеет неровные или завернутые края.
4. Контроль специфичности
Для контроля специфичности при каждом исследовании (независимо от применяемой методики) необходимо использовать стандартные D-положительные и D-отрицательные эритроциты.
4. Форма выпуска
Цоликлон Анти-D Супер выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 2,5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%
Срок хранения - один год в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон можно хранить в холодильнике в течение одного месяца в закрытом виде.
5. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флаконов, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным, протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2-3 невскрытых флакона данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению анти-Rho(D) IgМ моноклонального реагента для определения резус-принадлежности крови человека (Цоликлона анти-D Супер)", утвержденную Управлением научных исследований МЗ и МП РФ 14 июля 1994 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 11
Инструкция
по исследованию сыворотки на наличие резус-антител
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
I. Введение
Резус-антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, они не являются нормальным свойством сыворотки человека, а появляются в крови резус-отрицательных людей лишь при особых условиях.
Условиями, способствующими образованию резус-антител, являются введение резус-отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом.
Определение резус-антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью.
Определение резус-антител требуется также при подготовке материала в целях использования для приготовления сывороток антирезус.
Резус-антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные.
Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус-антигены.
Полные антитела, соединяясь с резус-антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется
Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус-антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин), или использование сыворотки для пробы Кумбса, реагирующей с человеческим белком (непрямая проба Кумбса). При всех перечисленных условиях реакция между резус-антителами и эритроцитами, содержащими резус-антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Разные методы определения резус-антител требуют различных оптимальных для них температурных условий.
II. Общие замечания
1. Учет специфичности антител. Специфичность стандартных эритроцитов
Наиболее часто при иммунизации резус-отрицательных людей повторными трансфузиями крови или беременностями образуются антитела анти-D, но при этих же условиях могут образоваться и другие резус-антитела. Поэтому при определении антител в сыворотке крови человека эту сыворотку испытывают с резус-положительными эритроцитами, обязательно содержащими антигены резус: D, С, Е, с, е.
Если антигены С и Е в эритроцитах специально не определялись, то число резус-положительных образцов должно быть не менее 20 для того, чтобы среди них обязательно встретились все антигены резус.
В качестве контроля на специфичность реакции, а также для выявления антител анти-с и е в исследование включаются стандартные резус-отрицательные - сcddee эритроциты и, если возможно, собственные эритроциты лица, сыворотка которого испытывается.
Такое исследование является предварительным. Для уточнения специфичности требуются дополнительные специальные исследования (см. п.IХ).
2. Учет формы антител
Чаще всего при иммунизации резус-антигеном образуются неполные антитела: иногда одновременно с ними образуются и полные. Кроме того, встречаются случаи, в которых у человека образуются только полные резус-антитела.
Поэтому определение резус-антител следует производить не менее чем двумя методами, одним из которых обязательно должен быть метод солевой агглютинации, выявляющий полные антитела, а другим - любой метод, выявляющий неполные антитела.
III. О выборе метода выявления резус-антител
Ниже в п.III, IV, V, VI описаны различные методы исследования сывороток. Из них непрямая проба Кумбса (см.III), реакция с применением желатина (см.IV) и реакция с применением полиглюкина (см.V) выявляют неполные резус-антитела, и для этой цели может быть использован любой из них.
Метод исследования сыворотки в солевой среде (см.VI) выявляет полные резус-антитела и должен обязательно использоваться одновременно с любым из упомянутых выше.
IV. Исследование сыворотки на наличие неполных резус-антител
непрямой пробой Кумбса
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки емкостью не менее 10 мл, содержащие 0,25 мл изотонического раствора лимоннокислого натрия. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Пробирки доливают доверху изотоническим раствором NаСl, затем содержимое пробирок перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды. После отмывания на дне пробирки остаются отмытые эритроциты, которые и применяют для исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают и нумеруют пробирки высотой 4-10 см с внутренним диаметром 0,5-0,8 см (первые размеры удобнее). Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) испытуемой сыворотки.
в. Со дна каждой пробирки, содержащей отмытые стандартные эритроциты, очень тонкой пастеровской пипеткой набирают маленькую каплю (0,01 мл) эритроцитов и переносят ее в пробирку с испытуемой сывороткой согласно нумерации пробирок.
г. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем встряхивания и помещают для инкубации в термостат на 45 мин. при температуре +37°С. За это время резус-антитела, если они имеются в испытуемой сыворотке, фиксируются на эритроцитах.
д. После инкубации в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют, после чего надосадочную жидкость отсасывают.
Такое отмывание эритроцитов повторяют 3-4 раза.
е. В каждую пробирку к отмытым таким образом эритроцитам добавляют 4-7 капель изотонического раствора NаСl для получения 5% взвеси (так как при отмывании эритроциты частично захватываются, интенсивность взвеси контролируют глазом).
ж. Одну каплю (0,05 мл) взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую фарфоровую или любую другую белую пластинку со смачиваемой поверхностью и к каждой капле прибавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки, приготовленной для пробы Кумбса.
з. Сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (стеклянной палочкой или углом предметного стекла), после чего пластинку слегка покачивают. При этом наблюдают результат (наличие или отсутствие агглютинации эритроцитов).
Агглютинация обычно начинается в течение первых 10-30 сек, но при слабом титре резус-антител может наступить до 20 мин.
3. Трактовка результата
Наличие агглютинации в каплях с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на присутствие в сыворотке неполных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела - анти-D, С, Е, с, и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п.IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по три капли (0,15 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку (с обозначением 1:2) вводят три капли (0,15 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания ее содержимого переносят три капли в следующую и т.д. до последней пробирки, из которой три капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения испытуемой сыворотки от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют пастеровской пипеткой по одной маленькой капле (0,01 мл) стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных так же, как готовят стандартные эритроциты.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив помещают на 45 мин. в термостат при температуре +37°С.
е. После инкубации эритроциты отмывают и из них готовят 5% взвесь. Затем из каждой пробирки переносят одну каплю (0,05 мл) взвеси на белую пластинку и к каждой капле взвеси прибавляют одну каплю (0,05 мл) сыворотки для пробы Кумбса, которую смешивают с эритроцитами. Далее в течение пяти минут наблюдают результат при покачивании пластинки.
ж. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация (время наблюдения 5 мин), принимается за титр выявленных неполных резус-антител. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
V. Исследование сыворотки на наличие неполных
резус-антител с применением желатина
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более, чем за 2-3 дня до исследования в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. При этом обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые и применяют для исследования. Эритроциты берут со дна пробирки пастеровской пипеткой: если при этом захватывается небольшое количество собственной сыворотки, это не влияет на ход реакции.
Если эритроцитов, оставшихся свободными после свертывания крови, недостаточно, то допускается интенсивное встряхивание свертка для отделения дополнительного количества эритроцитов.
Можно брать кровь с цитратом натрия. В этом случае эритроциты необходимо отмыть изотоническим раствором NаСl.
Для установления титра антител эритроциты готовят ех tempore. В пробирку к одной части эритроцитов добавляют 9 частей 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. При этом получается 10% взвесь эритроцитов в желатине.
2.Техника исследования
а. В штатив устанавливают тонкостенные пробирки высотой около 10 см, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. В пробирки в соответствии с их нумерацией вводят по одной капле (0,05 мл) эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
в. Во все пробирки прибавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, подогретого до разжижения. (Раствор желатина необходимо тщательно просмотреть перед применением. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойства застудневать при температуре 4-8°С желатин не пригоден).
г. После этого во все пробирки вводят по 1-2 капли (0,1 мл) испытуемой сыворотки, пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого и помещают в водяную баню при температуре 46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 45 мин.
д. В пробирки по извлечении из водяной бани наливают 5-8 мл изотонического раствора NаСl. Содержимое пробирок перемешивают путем одно - двукратного перевертывания их и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции просматривают на свет.
Содержимое пробирок, в которых при просмотре невооруженным глазом агглютинация не видна, необходимо микроскопировать.
Для этого каплю содержимого пробирки помещают с помощью стеклянной палочки на предметное стекло и просматривают под малым увеличением.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в испытуемой сыворотке неполных резус - антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные резус-антитела анти-D, С, Е, а также с и е - не выявлены.
Определение специфичности выявленных антител см. п.IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей неполные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначениями: 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024.
б. Во все пробирки вводят по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку этой же пипеткой вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. Из первой пробирки после перемешивания две капли переносят во вторую, из второй - в третью, из третьей - в четвертую и так до последней пробирки, из которой две капли удаляют. В результате в пробирках получаются разведения сывороток от 1:2 до 1:1024.
г. Во все пробирки добавляют по две капли стандартных резус - положительных эритроцитов или смеси эритроцитов, полученных от 4-5 резус-положительных лиц и приготовленных, как сказано ниже в виде 10% взвеси в желатине.
д. Пробирки встряхивают и помещают в водяную баню при температуре +46-48°С на 10 мин. или в суховоздушный термостат на 30 мин.
е. По извлечении пробирок из водяной бани в них доливают по 5-8 мл изотонического раствора NаСl и наблюдают результат. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимается за титр выявленных неполных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В этих случаях следует продолжать разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
VI. Исследование сыворотки на наличие неполных антител с применением
полиглюкина (в пробирках без подогрева)
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления эритроцитов берут не более чем за 2-3 дня до исследования в обычные пробирки. Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь. Может быть использована любая кровь: непосредственно взятая из пальца, эритроциты из осадка в пробирке после образования свертка и консервированная, отмытая изотоническим раствором NаСl.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают пробирки вместимостью 8-10 мл, которые нумеруют. Число и нумерация пробирок должны соответствовать числу и нумерации образцов эритроцитов, с которыми исследуется сыворотка.
б. Во все пробирки вводят по две капли исследуемой сыворотки.
в. Согласно нумерации в пробирки вводят по одной капле стандартных эритроцитов.
г. Во все пробирки вводят по одной капле 33% раствора полиглюкина.
д. Пробирки встряхивают для перемешивания их содержимого, затем наклоняют почти до горизонтального положения и медленно поворачивают по горизонтальной оси так, чтобы содержимое растекалось по их стенкам. Контакт эритроцитов с исследуемой сывороткой при поворачивании пробирок продолжают три минуты.
е. Через 3-5 мин в пробирки наливают 3-4 мл изотонического раствора NаСl, осторожно перемешивают содержимое путем 2-3-кратного перевертывания пробирки (не взбалтывать!) и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результатов
Результаты просматривают на свет невооруженным глазом.
Наличие агглютинации в пробирках с образцами резус - положительных эритроцитов и отсутствие ее с резус - отрицательными и собственными эритроцитами указывает на содержание в исследуемой сыворотке резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что неполные антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.
Определение специфичности антител см.п.IХ.
VII. Исследование сыворотки на наличие полных антител
в реакции агглютинации в солевой среде
1. Предварительная обработка стандартных эритроцитов
Кровь для приготовления стандартных эритроцитов берут в количестве 1-2 мл (и более, смотря по потребности) в пробирки вместимостью 8-10 мл, содержащие изотонический раствор лимонно-кислого натрия (из расчета 0,25 мл на 1 мл крови). Пробирки нумеруют и пишут на них фамилию и инициалы лица, от которого взята кровь.
После взятия крови в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, затем содержимое их перемешивают, центрифугируют и отсасывают отмывную жидкость. Такое отмывание повторяют дважды.
Можно брать кровь и без стабилизатора. В этом случае после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов готовят 2% взвесь в других пробирках, взятых по числу образцов стандартных эритроцитов и так же пронумерованных.
Для приготовления 2% взвеси в эти пробирки капают по 2,5 мл (49 капель) изотонического раствора NаСl и в каждую пробирку в соответствии с ее нумерацией переносят одну каплю эритроцитов. Содержимое пробирок перемешивают для получения равномерной 2% взвеси эритроцитов, которая применяется для исследования сыворотки.
2. Техника исследования
а. В штатив устанавливают ряд маленьких пробирок (высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см, с гладким дном округлой формы) по числу образцов эритроцитов, с которыми испытывается сыворотка. Предварительно штатив покрывают листом бумаги, в котором накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пробирки на бумаге пишут порядковый номер, а также фамилию, инициалы, группу крови и резус-принадлежность лица, от которого взята кровь.
Вместо пробирок можно использовать планшеты для иммунологических реакций с лунками, имеющими закругленное дно.
б. Во все пробирки (лунки планшета) вводят по одной капле (0,05 мл) испытуемой сыворотки и по одной капле изотонического раствора NаСl.
Штатив с пробирками (планшет) встряхивают для перемешивания их содержимого.
в. В пробирки (лунки), согласно их нумерации и обозначению, вводят по одной (0,05 мл) капле 2% взвеси эритроцитов, приготовленных в качестве стандартов.
г. Содержимое снова перемешивают и штатив (планшет) помещают для инкубации в термостат при +37°С на один час и затем оставляют на столе при комнатной температуре на 2-3 часа.
д. После инкубации штатив с пробирками (планшет) вынимают и наблюдают результат в виде наличия или отсутствия агглютинации эритроцитов.
3. Трактовка результата
Результат реакции учитывают при помощи лупы с 6-8-кратным увеличением по форме осадка эритроцитов на дне пробирки (лунки) (см. "Инструкцию по определению резус-принадлежности крови методом агглютинации в солевой среде").
Наличие агглютинации с резус-положительными образцами эритроцитов и отсутствие ее с резус-отрицательными и собственными эритроцитами указывают на присутствие в сыворотке полных резус-антител.
Отсутствие агглютинации со всеми образцами эритроцитов указывает на то, что полные резус антитела анти-D, С, Е, а также с и е не выявлены.
Определение специфичности см. п.IХ.
4. Титрование сыворотки, содержащей полные резус-антитела
а. В штатив устанавливают 10 маленьких пробирок для разведения сывороток 1:2, 1:4, 1:8 и т.д. до 1:1024. Можно использовать планшет для иммунологических реакций.
б. Во все пробирки (лунки) капают по две капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl.
в. В первую пробирку (лунку) (с обозначением 1:2) вводят две капли (0,1 мл) исследуемой сыворотки. После перемешивания из первой пробирки (лунки) переносят две капли во вторую, из второй - в третью и т.д. до последней, из которой две капли удаляют. В результате получаются разведения сыворотки от 1:2 до 1: 1024.
г. В каждую пробирку (лунку) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси стандартных эритроцитов или смеси, приготовленной от 4-5 резус-положительных лиц. Эритроциты для взвеси готовят, как сказано выше.
д. Содержимое пробирок перемешивают и штатив (планшет) помещают в термостат при температуре +37°С на один час.
е. После инкубации штатив (планшет) вынимают из термостата и наблюдают результат.
Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимают за титр выявленных полных резус-антител.
Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях сыворотки, то, следовательно, титр резус-антител выше 1:1024. В таких случаях следует продолжить разведение сыворотки и далее продолжать исследование, как сказано выше.
VIII. Феномен зоны
При очень высокой степени иммунизации организма образующиеся резус-антитела иногда дают феномен зоны. Этот феномен заключается в том, что сыворотка крови таких лиц, будучи взята неразведенной или в небольшом разведении (1:2), может не дать или дать слабую положительную реакцию при ее испытании с резус-положительными эритроцитами. Однако, если такую сыворотку развести, то при некотором разведении (чаще всего 1:8, 1:16, иногда и более) резус-антитела в ней становятся активными и дают хорошо выраженную положительную реакцию. Реже всего феномен зоны бывает выражен в методе конглютинации с желатином или при испытании сыворотки непрямой пробой Кумбса. Поэтому, а также ввиду большей ее чувствительности, проба Кумбса является очень ценной реакцией для выявления неполных резус-антител.
Если все методы, включая непрямую пробу Кумбса, не выявляют в сыворотке резус-антител, а в анамнезе у лица, кровь которого испытывается, есть указания на сенсибилизацию к резус - антигену, то для исключения феномена зоны следует испытать эту сыворотку, взятую в разведениях. Для этого сыворотка разводится и испытывается, как указано для каждого метода в разделах "Титрование сыворотки".
Если при наблюдении результата в каких-либо разведениях сыворотки отмечается положительная реакция, следовательно, в испытуемой сыворотке есть антитела. В этих случаях для дальнейшего исследования сыворотки ее следует развести, при этом выбрать то разведение, в котором наблюдалась наиболее выраженная положительная реакция. В качестве разводителя при исследовании применяют изотонический раствор NаСl. Исследование разведенной сыворотки проводится как описано выше для каждого метода. При установлении высоты титра учитывается общее разведение нативной сыворотки, начиная с 1:2.
IХ. Специфичность антител
Сыворотки, давшие положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, могут содержать как "чистые" антитела анти-D, так и одновременно антитела к нескольким антигенам: анти-С+D, анти-D+Е или анти-С+D+Е.
В некоторых случаях исследуемые сыворотки, содержащие резус-антитела, могут вызвать агглютинацию избирательно - не всех образцов резус-положительных эритроцитов. Это может быть связано с тем, что в испытуемой сыворотке имеются антитела не анти-D (наиболее часто встречающиеся, а анти-С или анти-Е).
Положительный результат может также наблюдаться и с резус-отрицательными эритроцитами за счет других антигенов системы резус - с, е или антигенов других систем.
Для выяснения специфичности резус-антител необходимо специальное исследование сыворотки с набором стандартных эритроцитов, включающих редкие группы ссDее, Сcddeе, ссddЕе, а также резус-отрицательные образцы (сcddeе), включающие как содержащие, так и не содержащие антигены Келл (К) и Даффи (Fу). С ними же проводится и титрование сыворотки.
Х. Общее заключение
1. Заключение о наличии в сыворотке резус-антител можно сделать при положительном результате, полученном любым методом исследования.
2. Заключение об отсутствии в сыворотке резус-антител можно сделать только при отрицательном результате, полученном при исследовании не менее чем двумя методами, одним из которых является любой метод, выявляющий неполные резус - антитела, а другим - реакция агглютинации в солевой среде, выявляющая полные резус-антитела. При этом следует учитывать возможный феномен зоны.
"Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/30, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 12
Инструкция
по изготовлению редких сывороток, предназначенных для определения
различных изоантигенов эритроцитов человека
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Введение
Под редкими группами крови понимаются такие сочетания групповых антигенов в эритроцитах человека, в которых: а) отсутствует какой-либо из антигенов высокой частоты, б) отсутствуют одновременно несколько антигенов, в том числе, активных и высокой частоты, в) содержатся различные редкие антигены; г) имеются редкие сочетания антигенов разных систем.
Под редкими сыворотками подразумеваются сыворотки крови людей, чаще с редкой группой крови, содержащие изоиммунные антитела, редко возникающие у людей вследствие естественной сенсибилизации при беременности. Причиной редкости такой сенсибилизации является редкость или наоборот высокая частота антигенов, против которых могут быть направлены антитела, а также низкая иммуногенная активность некоторых антигенов.
К редким сывороткам относятся моноспецифические сыворотки,
содержащие антитела к какому-либо одному антигену системы резус-С, Е, с,
w
е, С , или к одному из антигенов других систем - Келл, Даффи, Кидд,
Левис, Лютеран, МNSs и другие.
К редким сывороткам относятся также полиспецифические сыворотки,
содержащие два или более вида антител, одними из которых чаще всего
бывают антитела анти-D, а другими- антитела редкой специфичности. К
таким редким полиспецифическим сывороткам относятся сыворотки анти -
а
С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е, анти-D+анти-Fу , анти-D+Келл и другие
сочетания антител анти-D с какими-либо редкими антителами, а так же все
а
сочетания только редких антител, например анти-С+е, анти-С + анти-Fу и
т.д.
Трансфузионная терапия, проводимая лицам, принадлежащим к редким группам, повышает возможность образования редких антител, особенно, если кровь переливалась повторно и реципиент имел в прошлом беременности.
Реиммунизация соответствующим антигеном, проводимая лицам, иммунизированным естественным путем при беременности или вследствие трансфузий крови еще более повышает возможность образования активных редких антител.
Лица, иммунизированные естественным путем при беременности или вследствие гемотрансфузий, могут привлекаться в кадры доноров с дополнительной реиммунизацией соответствующим антигеном. Привлечение к донорству и реиммунизация для получения редких сывороток проводятся так же, как это предусмотрено для сывороток антирезус ("Инструкцией по иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Реиммунизация допустима для повышения активности любых антител, так как не вносит ничего качественно нового в иммунологический статус иммунизируемого лица, и следовательно, не создает дополнительной опасности в случае необходимости переливания крови.
Эффективной мерой получения некоторых редких сывороток является искусственная иммунизация доноров-добровольцев.
Искусственная иммунизация ранее несенсибилизированных лиц допустима только теми антигенами и при тех условиях, когда это не может повлечь каких-либо осложнений для иммунизируемого лица в смысле возможности неблагополучных исходов последующих беременностей или несовместимости в случае переливания крови.
Исходя из сказанного, а также из того, что потребность в редких сыворотках разной специфичности различна, для получения таких сывороток рекомендуется дифференцированный подход и разные способы.
2. Основное назначение редких сывороток в учреждениях Службы крови
Моноспецифические сыворотки антирезус - анти-С, анти-Е, анти-с,
w
анти-е, анти-С , а также моноспецифические сыворотки других систем
применяются наряду с сыворотками анти-D при фенотипировании крови
доноров для создания панели стандартных эритроцитов и кадров
типированных доноров, в том числе доноров редких групп, а также для
установления фенотипа крови больных и других лиц с целью выяснения
причин и предупреждения сенсибилизации и трансфузионных осложнений.
Полиспецифические сыворотки анти-С+D, анти-D+Е, анти-С+D+Е применяются при обследовании доноров и при обработке их крови на втором этапе исследования на резус-принадлежность. При этом сыворотки анти-С+D и анти-D+Е должны быть использованы одновременно или могут быть заменены одной сывороткой анти-С+D+Е (см. "Инструкцию по определению резус - принадлежности").
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела
а
других систем, например анти-Fу или анти-Келл, являющиеся главным
образом случайными находками, могут быть использованы при исследовании
крови резус - отрицательных лиц для определения у них антигенов, против
которых направлены дополнительные антитела.
3. Источники и способы получения сыворотки
Для получения моноспецифических сывороток анти-С и анти-Е необходимо выявление лиц, сенсибилизированных естественным путем, и привлечение их к донорству с последующей реиммунизацией.
Допускается искусственная иммунизация этими антигенами доноров добровольцев, которая требует длительных курсов, так как не всегда бывает успешной, особенно для получения активных сывороток анти-С.
Моноспецифические сыворотки анти-с и анти-е следует получать только от лиц, сенсибилизированных естественным путем. Рекомендуется привлечение таких лиц к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация антигеном с и антигеном е недопустима, так как в этих случаях нужно было бы иммунизировать резус - положительных лиц, то есть сделать их реципиентами, для которых будет несовместимой вся резус-отрицательная и в большинстве случаев резус-положительная кровь.
Моноспецифические сыворотки анти-Келл, анти-Даффи, анти-Кидд,
w
анти-S, анти-s, анти-С следует получать от лиц, сенсибилизированных
естественным путем. Поскольку такие антитела возникают исключительно
редко, чаще всего при беременности в сочетании с многократными
трансфузиями крови, то выявление таких сенсибилизированных лиц, то есть
первичный поиск редких антител следует организовать с привлечением к
этой работе отделений переливания крови при больницах.
После выздоровления этих лиц желательно привлекать к донорству с
последующей реиммунизацией.
w
Искусственная иммунизация антигенами Келл, Даффи, Кидд, S, е, С
разрешается только для ограниченного числа доноров в институтах
переливания крови, а также в Центре изосерологических стандартов при
Нижегородской областной станции переливания крови и Станции переливания
крови Комитета здравоохранения г.Москвы.
Моноспецифические сыворотки анти-М, анти-N, анти-Р, анти-Левис могут быть выявлены при массовых обследованиях крови доноров, поскольку такие антитела иногда (очень редко) бывают у людей врожденными. Также редко встречаются такие антитела у лиц, сенсибилизированных естественным путем - беременностями и трансфузиями крови. Таких лиц следует привлекать к донорству с последующей реиммунизацией. Искусственная иммунизация этими антигенами противопоказана.
Систематическое получение сывороток анти-М, анти-N, анти-Р и анти - Левис производятся путем иммунизации животных в учреждениях судебной медицины.
Сыворотки двойной специфичности анти-С+D следует получать от лиц, сенсибилизированных естественным путем с последующим привлечением их к донорству и реиммунизации.
Сыворотки двойной и тройной специфичности - анти-D+Е и анти - С+D+Е могут быть получены почти исключительно путем искусственной иммунизации доноров - добровольцев, так как такое сочетание антител очень редко возникает при естественной сенсибилизации.
Антитела специфичности анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+E иногда образуются при искусственной иммунизации доноров-добровольцев антигеном D. В этих случаях допустимо продолжение иммунизации с использованием тех антигенов, против которых требуется повысить титр антител.
Сыворотки анти-D в сочетании с антителами какой-либо другой специфичности могут быть получены от лиц сенсибилизированных естественным путем при беременности и трансфузиях крови и при этом на протяжении небольшого срока, так как редкие антитела у таких сенсибилизированных лиц быстро ослабевают или исчезают из крови. Искусственная иммунизация для получения таких сывороток противопоказана.
4. Методы иммунизации и реиммунизации
Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С и анти-Е следует производить согласно инструкции "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус".
Реиммунизацию с целью получения антител другой специфичности следует производить аналогично реиммунизации антигенами С и Е с использованием эритроцитов соответствующего фенотипа. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов.
Иммунизацию антигенами системы Келл, Даффи, Кидд, антигенами S, s, w С следует производить аналогично иммунизации антигенами С и Е. Возможны некоторые изменения в дозах и сроках введения эритроцитов. Иммунизацию и реиммунизацию для получения сывороток анти-С+D, анти-D+Е и анти-С+D+Е, следует производить на фоне уже имеющихся активных антител анти-D, вводя те антигены, против которых имеются дополнительные антитела. Дозы введения антигена аналогичны дозам при иммунизации антигенами С и Е. Длительность курса зависит от срока появления антител.
Иммунизированным и реиммунизированным лицам выдается справка по форме, предусмотренной действующей инструкцией "По иммунизации доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус" с указанием антигена, которым проводилась иммунизация. Иммунизация животных для получения сывороток анти-М и анти-N, анти-Р, анти-Левис и обработка этих сывороток производится согласно ТУ и лабораторным регламентам на эти сыворотки.
5. Методы и дозы взятия крови
У лиц, содержащих антитела, следует брать кровь для последующего получения сыворотки или плазмы (методом плазмафереза).
Дозы взятия крови и плазмы зависят от состояния здоровья таких лиц и предусмотрены действующими инструкциями "О порядке сбора крови, содержащей изоиммунные антитела, пригодные для изготовления стандартных сывороток" и "По медицинскому освидетельствованию доноров крови".
6. Показатели пригодности редких сывороток для практического использования
Сыворотки должны быть прозрачными или слегка опалесцировать. Допустим красный оттенок цвета, а также желтое окрашивание вследствие присутствия желчных пигментов.
Моноспецифические редкие сыворотки рекомендуются для практического использования при титре полных или неполных антител не ниже 1:16. Ввиду редкости и трудности получения таких сывороток, при хорошем авидитете допускается использование их с титром 1:4.
Сыворотки анти-С+D, анти-D+E и анти-С+D+Е должны иметь титры антител анти-D не ниже: полных - 1:16, неполных - 1:32. Титр антител анти-С и анти-Е как полных, так и неполных должен быть не ниже 1:16.
Сыворотки, содержащие антитела анти-D и дополнительно антитела к антигенам других систем, годны для использования в руках специалистов серологических лабораторий учреждений Службы крови при любом титре антител от 1:4 при хорошем их авидитете. Выдача комбинированных сывороток в другие учреждения допустима лишь при титре всех антител не ниже 1:16. Если в сыворотке, содержащей редкие антитела одной специфичности, одновременно содержатся другие антитела с низким титром и слабым авидититом, то сыворотка нуждается в абсорбции или может быть использована в руках специалистов в институтах, на станциях переливания крови. Выдаче в другие учреждения без абсорбции такая сыворотка не подлежит.
7. Организация поиска и первичное исследование сывороток
Поскольку изоиммунные антитела возникают редко, для получения сывороток редкой специфичности следует организовать работу по выявлению сенсибилизированных лиц как среди резус - отрицательных, так среди резус - положительных больных и доноров с привлечением к этой работе лабораторий, в которых проводятся определение резус - принадлежности крови.
Первичное исследование сывороток лиц с подозрением на сенсибилизацию производится в учреждениях Службы крови, включая отделения переливания крови при больницах. Первичное исследование сывороток лиц, подвергающихся искусственной иммунизации, производится на станциях переливания крови, производящих иммунизацию.
Первичное исследование проводится непрямой пробой Кумбса или реакцией конглютинации с применением желатина для выявления неполных антител и реакцией агглютинации в солевой среде для выявления полных антител.
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6