Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2 "Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года
Страница 2
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6
д) предохранена от инфицирования консервированием;
е) имеет точную паспортизацию.
При соответствии этим требованиям сыворотке присваивается номер серии и она может быть разлита и выпущена как стандартная изогемагглютинирующая сыворотка для определения групп крови АВО с соответствующей записью в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
ХIХ. Розлив
Сыворотку групп О-альфа бета(I), А-бета(II) и В-aльфа(III) разливают во флаконы или ампулы по 1-5 мл, сыворотку АВ(IV) - по 0,5 мл.
Запрещается разливать сыворотки разных групп одновременно в одном помещении.
Немедленно после розлива на флаконы (ампулы) наклеивают этикетки. Флаконы закупоривают, ампулы запаивают.
XX. Паспортизация разлитой сыворотки
1. Этикетки, наклеиваемые на флаконы (ампулы) с разлитой сывороткой, должны содержать следующие сведения:
а) название учреждения, в котором изготовлена сыворотка;
б) групповую принадлежность сыворотки с обязательным указанием агглютининов;
в) номер серии;
г) титр агглютининов в сыворотке. Титр альфа-агглютинина указывается по отношению к эритроцитам группы А1. Для сыворотки группы О-альфа бета(I) указывается титр только одного агглютинина альфа или бета и из них того, который слабее;
д) срок годности: число, месяц, год;
е) на этикетке наносят по диагонали цветные полосы:
для группы А(II)- две синие,
для группы В(III) - три красные,
для группы АВ(IV) - четыре желтые.
2. Этикетки изготавливают типографским способом, оставляя свободные места для цифровых обозначений (номера серии, титра и срока годности), которые вносят на этикетку к моменту розлива. Форму этикетки - см. Рисунок 1.
3. Сыворотку, разлитую во флаконы (ампулы), регистрируют в "Журнале для регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
--------------------------------¬ ---------------------------------¬ ¦ Наименование учреждения ¦ ¦ Наименование учреждения ¦ ¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦ +-------------------------------+ +--------------------------------+ ¦Изогемагглютинирующая ¦ ¦Изогемагглютинирующая ¦ ¦сыворотка группы Оальфа бета(I)¦ ¦сыворотка группы Оальфа бета(II)¦ ¦ АНТИ - (А+В) ¦ ¦ АНТИ - В ¦ ¦Серия ........... Титр ........¦ ¦Серия ........... Титр .........¦ ¦мл ......... годна до .........¦ ¦мл ......... годна до ..........¦ L-------------------------------- L--------------------------------- --------------------------------¬ ---------------------------------¬ ¦ Наименование учреждения ¦ ¦ Наименование учреждения ¦ ¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦ +-------------------------------+ +--------------------------------+ ¦Изогемагглютинирующая ¦ ¦Изогемагглютинирующая ¦ ¦сыворотка группы B альфа(III) ¦ ¦сыворотка группы ABo(IV) ¦ ¦ АНТИ - A ¦ ¦ ¦ ¦Серия ........... Титр ........¦ ¦Серия ........... ......¦ ¦мл ......... годна до .........¦ ¦мл ......... годна до ..........¦ L-------------------------------- L---------------------------------
Рис. 1. Форма этикеток стандартных изогемагглютинирующих сывороток системы АВО.
На этикетки наносят по диагонали цветные полосы:
- для сыворотки группы А бета(II) - две синие;
- для сыворотки группы В альфа(III) - три красные;
- для сыворотки группы АВо(IV) - четыре желтые.
Возможно печатать таким же цветом полностью текст этикеток.
ХХI. Срок годности стандартной изогемагглютинирующей сыворотки
Срок годности стандартной сыворотки устанавливают 6 месяцев с момента ее розлива.
Сыворотку, срок годности которой истек, можно проверить и при условии, если она сохранила без изменения свои свойства (см.разд.ХVIII), продлить срок годности еще на 2 месяца.
ХХII. Контроль разлитой сыворотки
Контроль разлитой сыворотки производят в пределах срока ее годности. Для этого из каждой серии разлитой сыворотки в лаборатории оставляют несколько ампул, которые сохраняют как образцы для последующего контроля.
Контроль заключается в проверке внешнего вида сыворотки и сохранения ее специфичности и активности.
При контрольной проверке к сыворотке предъявляют следующие требования:
а) отсутствие помутнения, выпадения осадка и потемнения;
б) отсутствие способности вызывать неспецифическую агглютинацию и гемолиз эритроцитов;
в) наступление агглютинации с эритроцитами групп А1 и В не позднее, чем в течение 30 секунд и с эритроцитами группы А2 не позднее, чем в течение одной минуты;
г) сохранение титра агглютининов на высоте, установленной при втором контроле сыворотки до розлива.
Если титр снизился (не более, чем на одну ступень), но высота его не ниже требований, указанных в разделе II.б, то сыворотку проверяют еще через пять и десять дней. Если титр далее не снижается, сыворотку считают пригодной.
ХХIII. Методика титрования при контроле разлитой сыворотки
При контроле разлитой сыворотки титр можно определять более простым cпособом. Испытуемую сыворотку разводят изотоническим раствором NаСl соответственно указанному на ней титру. Например, при титре 1:64 в пробирку накапывают 63 капли изотонического раствора и той же пипеткой одну каплю испытуемой сыворотки. Сыворотку тщательно перемешивают с изотоническим раствором и одну каплю смеси переносят на пластинку. Сюда же прибавляют одну маленькую (приблизительно в 10 раз меньшую) каплю стандартных эритроцитов соответствующей группы. Эритроциты перемешивают с сывороткой и наблюдают за результатом при покачивании пластинки в течение пяти минут.
Если за это время появилась агглютинация, значит, титр сыворотки не снизился. Если в течение пяти минут агглютинация не наступила, значит, титр сыворотки снизился. В этих случаях для установления величины титра сыворотку титруют вновь, как указано в разделе IV.5.
ХХIV. Брак разлитой сыворотки в пределах указанного срока годности
Если при контроле разлитой сыворотки окажется, что она не соответствует предъявляемым требованиям (см. раздел ХХII, а, б, в, г), то сыворотку считают непригодной и ликвидируют.
В учреждения, в которые эта сыворотка была отпущена, немедленно сообщают по телефону или телеграфом о непригодности данной серии сыворотки.
Сыворотку, возвращенную из других учреждений из-за непригодности, ликвидируют так же, как сыворотку этой серии, оставшуюся неиспользованной в лаборатории, ее изготовившей.
ХХV. Выдача сыворотки
Сыворотку выдают по требованиям учреждений, в которых определяют группу крови.
Выдают сыворотку комплектом в равных количествах групп О альфа бета(I), А бета(II), и В aльфа(III). Сыворотку группы АВо(IV) выдают по 1 мл на 15 мл общего количества сыворотки других трех групп. При выдаче сыворотки к ней обязательно прикладывают инструкцию по использованию (см. п.ХХIХ, Дополнение 1).
ХХVI. Хранение сыворотки
Сыворотку на всех стадиях ее изготовления можно хранить при комнатной температуре или в холодильнике при 4-8°С. Если сыворотка замерзла, это не меняет ее свойства и она может быть использована после полного ее оттаивания.
ХХVII. Общие сведения о паспортизации сыворотки
Под паспортизацией подразумевают запись на флаконе всех сведений о находящейся в нем порции исходного материала, из которого получается сыворотка, и последовательную запись всех результатов, полученных при исследовании исходного материала, а затем сыворотки в процессе ее изготовления и контроля.
Паспортные записи производятся:
а) на флаконе с исходным материалом. Эти записи постепенно пополняются и переносятся с флакона на флакон по мере обработки и исследования этой порции сыворотки;
б) на этикетке, наклеиваемой на флакон или ампулы с разлитой сывороткой;
в) в "Журнале регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО".
г) в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО".
ХХVIII. Паспортные записи в журналах
а) В "Журнал регистрации материала, поступающего для изготовления стандартной сыворотки системы АВО" записывают все сведения о поступившем материале и полученной из него сыворотки, включая контрольные исследования, проведенные до момента розлива сыворотки.
При смешивании сывороток различных серий смесь записывают под новым номером.
Записи в этом журнале повторяют записи на флаконах с неразлитой сывороткой.
б) В "Журнал регистрации изготовленной стандартной сыворотки системы АВО" записывают сведения о сыворотке с момента ее розлива. В этот журнал вносят сведения, имеющиеся на этикетке разлитой сыворотки, и делают дополнительные записи о дате розлива и результатах контрольных проверок разлитой сыворотки. В этот же журнал записывают, куда и сколько было отпущено сыворотки каждой серии.
Нумерацию серий начинают с 1 января каждого года и ведут независимо от групповой принадлежности сыворотки.
Дополнение 1
ХХIХ. Инструкция по применению
изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО
(прилагается при выдаче сыворотки)
Техника реакции
Определение группы крови АВО производится стандартными изогемагглютинирующими сыворотками на плоскости при комнатной температуре.
Стандартные сыворотки наносят на белую пластинку со смачиваемой поверхностью по одной большой капле (0,1 мл) у предварительно надписанного обозначения. Во избежание ошибки при каждом определении группы крови применяют по два образца сывороток каждой группы (разные серии), так что они образуют два ряда капель в следующем порядке по горизонтали: О альфа бета(анти-(А+В)), А бета(анти-В) и В альфа(анти-А).
Исследуемую кровь наносят по одной маленькой капле, приблизительно в 10 раз меньше капли сыворотки (0,01 мл), рядом с каждой каплей сыворотки. Кровь тщательно перемешивают с сывороткой стеклянной палочкой или углом предметного стекла, которые промывают и досуха вытирают перед размешиванием каждой капли.
Результат реакции
Наблюдение за ходом реакции производят при легком покачивании пластинки в течение пяти минут.
Результат реакции в каждой капле может быть положительным (+) или отрицательным (-).
Положительный результат (+) выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов - агглютинаты видны невооруженным глазом сначала в виде мелких красных зернышек, постепенно сливающихся в более крупные хлопья. При этом сыворотка постепенно обесцвечивается.
При отрицательной реакции (-) капля остается равномерно окрашенной.
Агглютинация наступает обычно в течение 10-30 секунд, однако наблюдение проводят не менее пяти минут ввиду возможности позднего наступления агглютинации в случае слабой агглютинабельности эритроцитов (А2 или А2В).
По мере наступления агглютинации, но не ранее трех минут, в эти капли добавляют по одной большой капле (0,1 мл) изотонического раствора NаСl для разрушения иногда наступающей ложной агглютинации - неспецифического склеивания эритроцитов, в том числе в так называемые монетные столбики.
В тех случаях, когда положительный результат получается со стандартными сыворотками всех групп (во всех каплях), для исключения неспецифической агглютинации производится дополнительное контрольное исследование испытуемых эритроцитов со стандартной сывороткой группы АВо(IV), не содержащей групповых агглютининов. Лишь отсутствие агглютинации с сывороткой группы АВо(IV) позволяет учесть положительный результат реакции с сыворотками О альфа бета(I) (анти-А+В), А бета(II) (анти-В) и В альфа(III) (анти-А) как истинный.
----------------------------------------------T-------------------------¬ ¦ Изогемагглютинирующие сыворотки группы ¦ ¦ +-------------T------------T------------------+ ¦ ¦ О альфа бета¦ А бета(II)¦ В aльфа(III) ¦ Исследуемая кровь ¦ ¦ (I) ¦ ¦ ¦ принадлежит к группе ¦ ¦ Анти-(А+В) ¦ Анти-В ¦ Анти-А ¦ ¦ +-------------+------------+------------------+-------------------------+ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ О (I) ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦ +-------------+------------+------------------+-------------------------+ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ А (II) ¦ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ ¦ +-------------+------------+------------------+-------------------------+ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ В(III) ¦ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ +-------------+------------+------------------+-------------------------+ ¦ + + + ¦ ¦ ¦ + + + ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Контроль с сывороткой группы АВо(IV) ¦ АВ (IV) ¦ L---------------------------------------------+--------------------------
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы.
Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации,
знаком минус (-) - отсутствие ее.
Примечание.
1. При использовании сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сывороток каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.
2. Уточнение техники реакции, оценки результатов, возможные ошибки и другие подробности см. в "Инструкции по определению групп крови системы АВО".
Дополнение 2
ХХХ. Подготовка и применение красок при
приготовлении стандартных изогемагглютинирующих сывороток
Для окрашивания изогемагглютинирующих сывороток используются следующие красители:
- для сыворотки группы А-бета(II) - метиленовая синяя, бриллиантовая зелень и трипан-блау вместе или любые две из них, взятые в равных количествах;
- для сыворотки группы В-альфа(III) - эозин (ВА), эозин натрия или конгорот;
- для сыворотки группы АВо(IV) - уранин (флуоресцеин растворимый - динатрий флюоресцеинат).
Краски растворяют в дистиллированной воде или изотоническом растворе NаСl до получения пересыщенного раствора (1 гр. на 50 мл жидкости). Краситель приготавливают, исходя из потребности 50-100 мл, и сохраняют для использования.
При изготовлении сывороток немедленно после фильтрования соответствующие растворы красок добавляют по 3-5 капель на каждые 100 мл сыворотки до получения требуемой окраски: синий или сине-зеленый для группы А-бета(II), светло-красный для группы В-альфа(II) и желтый для группы АВо(IV).
Следует иметь ввиду, что иногда при хранении запаянных ампул на свету синяя краска в сыворотке группы А-бета(II) слегка выцветает, но она восстанавливается после вскрытия ампулы (флакона).
Использование красок безвредно для сывороток, не влияет на титр и срок их годности.
"Инструкцию по изготовлению стандартных изогемагглютинирующих сывороток для определения групп крови системы АВО", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 07 сентября 1990 года N 05-14/26, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 3
Инструкция
по определению групп крови системы АВО при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Введение
Под группами крови АВО подразумеваются различные сочетания антигенных свойств эритроцитов (агглютиногенов) и антител по отношению к ним (агглютининов), находящихся в плазме крови.
Существуют два групповых агглютиногена - А и В, и два агглютинина - альфа и бета. Различные сочетания этих свойств образуют четыре группы крови: О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и АВо (IV).
Возможны два способа определения группы крови:
1. Определение группы крови при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При этом способе в крови устанавливают наличие или отсутствие агглютиногенов и, исходя из этого, делают заключение о групповой принадлежности исследуемой крови.
2. Определение группы крови перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов. При этом способе, так же как и при первом, определяют наличие или отсутствие агглютиногенов и, кроме того, при помощи стандартных эритроцитов устанавливают наличие или отсутствие групповых агглютининов.
Группа крови у больных и других лиц, которым предполагается сделать переливание крови, определяется сертифицированным специалистом, имеющим специальную подготовку. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определения группы повторяют.
Результат определения группы крови записывается в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни с указанием даты и за подписью специалиста, производившего определение.
Группа крови у доноров определяется два раза сертифицированным специалистом: один раз при первичном обращении донора при помощи стандартных сывороток двух различных серий каждой группы; и второй раз при окончательном зачислении в доноры - перекрестным способом, т.е. одновременно при помощи стандартных сывороток (также двух различных серий каждой группы) и стандартных эритроцитов. Результат обоих определений записывается на лицевой стороне донорского журнала (карты) с указанием даты и за подписью лиц, определявших группу крови.
Примечание: При использовании изогемагглютинирующих сывороток с титром не ниже, чем 1:64 разрешается проводить первичное определение группы крови у доноров и больных одной серией сыворотки каждой группы. При повторном и перекрестном определении можно использовать также сыворотки одной серии (с титром не ниже, чем 1:64), но отличающиеся от тех серий, которые были применены при первичном определении.
Специальное оснащение
а. Стандартные изогемагглютинирующие сыворотки групп О-альфа бета(I), А-бета(II), В-aльфа(III) и стандартная сыворотка группы АВо(IV).
б. Стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III).*(6)
в. Изотонический раствор NаСl.
г. Белые фарфоровые или любые другие белые пластинки со смачиваемой поверхностью.
д. Пипетки.
е. Стеклянные или пластмассовые палочки для перемешивания капель крови и сыворотки.
Подготовительная работа
а. Определение группы крови производят в помещении с хорошим освещением при температуре 15-25°С.
б. Ампулы, флаконы со стандартными сыворотками ставят в штатив с тремя гнездами (или в два штатива - при использовании двух серий сыворотки каждой группы). В левые гнезда ставят сыворотку группы О-альфа(I), в средние - сыворотку группы А-бета(II) и в правые - сыворотку группы В-aльфа(III). В ампулы опускают сухие чистые пипетки. Отдельно ставят сыворотку группы АВо (IV), употребляемую в качестве дополнительного контроля (см. раздел IV, в). Этот набор дополняют пробиркой или флаконом с изотоническим раствором NаСl.
в. Для определения группы крови перекрестным способом, кроме стандартных сывороток, подготавливают также стандартные эритроциты групп О(I), А(II) и В(III). Пробирки со стандартными эритроцитами устанавливают в маленький (на три гнезда) штатив в следующем порядке: слева - группы О(I), в середине - группы А(II) и справа - группы В(III).
г. Для промывания стеклянных, пластмассовых палочек и пипеток подготавливают стаканы с водой и с изотоническим раствором NаСl.
Техника определения группы крови при помощи стандартных сывороток
а. На левой стороне пластинки надписывают О-альфа бета[анти-(А+В)], в середине - А-бета(анти-В) и справа - В-альфа(анти-А), на верхнем крае - фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.
Под соответствующим обозначением группы крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки соответствующей группы. Если используют стандартные сыворотки двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: O-альфа бета[анти-(А+В), А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А)].
Сыворотку берут из ампулы пипеткой, которую тотчас же после того, как из нее была выпущена сыворотка, опускают в ту же ампулу с сывороткой, из которой она была взята.
б. Кровь для исследования берут из места укола мякоти пальца или мочки уха. Капли крови величиной приблизительно 0,01 мл последовательно наносят сухой стеклянной палочкой на пластинку, каждую рядом с каплей стандартной сыворотки (количество испытуемой крови должно быть приблизительно в 10 раз меньше количества стандартной сыворотки, с которой она смешивается).
в. Другой стеклянной палочкой перемешивают каплю крови с сывороткой группы О-альфа бета[анти-(А+В)] до тех пор, пока смесь не окрасится равномерно в красный цвет. Другой стеклянной палочкой перемешивают следующую каплю крови с сывороткой группы А-бета(анти-В) и так же поступают с сывороткой В-альфа(анти-А). При использовании двух серий сывороток так же делают во втором ряду. Можно перемешивать кровь с сывороткой одной и той же палочкой, но в этом случае необходимо после размешивания каждой капли промывать палочку в стакане с водой и насухо ее вытирать.
г. После размешивания капель пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают.
Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Хотя агглютинация начинается в течение первых 10 - 30 секунд, наблюдение следует вести и далее - до пяти минут в виду возможности более поздней агглютинации, например, с эритроцитами группы А2(II).
д. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через три минуты, в капли смеси сыворотки с эритроцитами, в которых наступила агглютинация, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при периодическом покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов реакции при определении группы крови
при помощи стандартных сывороток
Реакция гемагглютинации в каждой капле может быть положительной или отрицательной.
При положительной реакции обычно в течение первых 10-30 секунд от начала перемешивания в смеси появляются видимые невооруженным глазом мелкие красные комочки (агглютинаты), состоящие из склеенных эритроцитов. Мелкие комочки постепенно сливаются в более крупные, а иногда в хлопья неправильной формы. При этом сыворотка полностью или почти полностью обесцвечивается.
При отрицательной реакции жидкость все время (5 минут) остается равномерно окрашенной в красный цвет и в ней не обнаруживается никаких агглютинатов.
Результаты реакций в каплях с сывороткой одной и той же группы должны совпадать.
Результаты с сыворотками трех групп: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А) могут дать четыре различные комбинации положительных и отрицательных реакций (см.табл.1).
а. Если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. все смеси остались равномерно окрашенными в красный цвет без признаков агглютинации, это значит, что кровь не содержит агглютиногенов А и В, т.е. принадлежит к группе О(I).
б. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и В-альфа(анти-А) дали положительную реакцию, а сыворотка группы А-бета(анти-В) - отрицательную, это значит, что кровь содержит агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А(II).
в. Если сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)] и А-бета(анти-В) дали положительную реакцию, а сыворотка группы В-альфа(анти-А) - отрицательную, то исследуемая кровь содержит агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В(III).
г. Если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что исследуемая кровь содержит оба агглютиногена - А и В, и принадлежит к группе АВ(IV). Однако, в этих случаях для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВо(IV). Для этого на пластинку наносят большую каплю (0,1 мл) сыворотки группы АВо(IV) (контроль) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови. Сыворотку и кровь перемешивают, после чего наблюдают за результатом в течение 5 минут при покачивании пластинки. Лишь отсутствие агглютинации в этой капле, при наличии ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки групп О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А), позволяет считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ(IV).
Техника определения группы крови перекрестным способом при помощи
стандартных изогемагглютинирующих сывороток и стандартных эритроцитов
а. Определение группы крови перекрестным способом заключается в одновременном определении групповых агглютиногенов в эритроцитах испытуемой крови при помощи стандартных сывороток и групповых агглютининов в сыворотке исследуемой крови при помощи стандартных эритроцитов.
б. Для определения группы крови перекрестным способом кроме стандартных сывороток используют стандартные эритроциты группы О(I), А(II) и В(III).
в. Кровь для исследования берут из вены или места укола пальца в сухую пробирку. Кровь центрифугируют или оставляют в покое на 20-30 минут для отделения сыворотки (для лучшего отделения сыворотки через 3-5 минут следует отделить сверток от стенок пробирки, обведя его стеклянной палочкой).
г. Определение производят на белой пластинке, на верхнюю часть которой наносят обозначения слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А). На верхнем крае надписывают фамилию и инициалы лица, у которого определяют группу крови.
д. Под соответствующими обозначениями групп крови на пластинку наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартных изогемагглютинирующих сывороток. При использовании стандартных сывороток двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют два ряда по три капли в следующем порядке слева направо: О-альфа бета[анти-(А+В)], А-бета(анти-В) и В-альфа(анти-А).
е. На правую часть пластинки также под соответствующими обозначениями наносят по одной маленькой (0,01 мл) капле стандартных эритроцитов в следующем порядке слева направо: О(I), А(II) и В(III).
ж. Из пробирки, содержащей кровь больного, пипеткой извлекают сыворотку (осторожно, чтобы не взболтать эритроциты) и накапывают ее по одной большой (0,1 мл) капле на подготовленные стандартные эритроциты. После этого той же пипеткой набирают со дна пробирки эритроциты испытуемой крови и наносят их по маленькой (0,01 мл) капле рядом с каждой каплей подготовленной стандартной сыворотки.
з. Во всех каплях сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами (сухой стеклянной палочкой), пластинку покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают. Наблюдение за ходом реакции проводят не менее пяти минут. Агглютинация в каплях со стандартной сывороткой обычно начинается быстро (10-30 секунд). Агглютинация в каплях, в которых сыворотку крови испытывают со стандартными эритроцитами, может наступить поздно (к концу пятой минуты), в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов.
и. По мере наступления агглютинации, но не ранее чем через 3 минуты в те капли, в которых она наступила, добавляют по одной капле (0,05 мл) изотонического раствора NаСl и продолжают наблюдение при покачивании пластинки до истечения пяти минут.
Трактовка результатов при определении группы крови
перекрестным способом
Учет реакции производится путем сопоставления результатов, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов (см. табл.2).
Результаты реакций, полученных при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов, должны совпадать, т.е. указывать на содержание агглютиногенов и агглютининов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в четырех различных комбинациях.
а. Реакция со стандартными сыворотками указывает на отсутствие групповых агглютиногенов, т.е. на принадлежность исследуемой крови к группе О(I) (см.раздел IV.а). При этом сыворотка исследуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы O(I) и положительную - с эритроцитами групп А(II) и В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютининов aльфа и бета, т.е. подтверждает принадлежность исследуемой крови к группе О-альфа бета(I).
б. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногена А (см. раздел IV.б). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп O(I) и А(II), но положительную с эритроцитами группы В(III). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина бета, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе А-бета(II).
в. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови определяется наличие агглютиногена В (раздел IV,в). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп О(I) и B(III), но положительную с эритроцитами группы А(II). Это указывает на наличие в исследуемой крови агглютинина альфа, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе В-альфа(III).
г. При помощи стандартных сывороток в исследуемой крови устанавливается наличие агглютиногенов А и В, и исследование с контрольной сывороткой группы АВ(IV) подтверждает специфичность реакции (см.раздел IV.г). При этом сыворотка исследуемой крови дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп, что указывает на отсутствие агглютининов в исследуемой крови, т.е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе АВо(IV).
Причины ошибок и меры их предупреждения
Отступление от изложенных правил может привести к ошибочным заключениям о групповой принадлежности исследуемой крови.
Отступлением от правил могут явиться: ошибочный порядок расположения стандартных сывороток или эритроцитов в штативах, ошибочный порядок нанесения их на пластинку, неправильное соотношение количества сыворотки и эритроцитов, несоблюдение времени, необходимого для проведения реакции (5 минут), неиспользование контрольной реакции c сывороткой группы АВо(IV), загрязнение или применение мокрых пипеток, пластинок, палочек, а также использование недоброкачественных стандартов, например, сыворотки с истекшим сроком годности (недостаточно активной), загрязненной или частично высохшей сыворотки, которая может вызвать неспецифическую реакцию агглютинации и т.д.
Эти отступления и связанные с ними ошибки могут привести к неправильной оценке результата реакции в целом и в каждой отдельной капле. Последнее может заключаться в следующем:
Лицо, определяющее группу крови, считает, что агглютинации не произошло, в то время как она фактически есть или должна появиться.
Лицо, определяющее группу крови, предполагает, что произошла агглютинация, в то время как она фактически отсутствует.
Первая ошибка, т.е. учет реакции как отрицательной при фактическом наличии агглютинации, может произойти:
а) в тех случаях, когда агглютинация начинается поздно или бывает слабо выражена. Это может зависеть от того, что стандартные сыворотки малоактивны, или от того, что эритроциты исследуемого лица обладают слабой агглютинабельностью. При одновременном наличии этих двух причин агглютинация может совсем не появиться, например, если малоактивная сыворотка группы В-альфа(анти-А) не даст агглютинации с эритроцитами группы А(II), если агглютинабельность последних низкая, например, подгруппа А2.
Во избежание этой ошибки необходимо наблюдать за ходом реакции не менее пяти минут и особенно внимательно за теми каплями, в которых еще не наступила агглютинация, а также работать только с активными сыворотками, агглютинирующая способность которых проверена и соответствует требованиям инструкции и в пределах срока ее годности;
б) при избытке крови, если взята слишком большая капля.
Во избежание этой ошибки следует соблюдать соотношение объема исследуемой крови и стандартной сыворотки (или стандартных эритроцитов и исследуемой сыворотки) приблизительно 1:10;
в) при высокой температуре (выше 25°С) окружающего воздуха например, в жаркую погоду (см.раздел II, а).
Во избежание этой ошибки пластинку, на которой определяется группа крови, следует охладить.
Вторая ошибка, т.е. учет реакции как положительной при фактическом отсутствии агглютинации, может произойти:
а) когда эритроциты испытуемой крови складываются в "монетные столбики", которые невооруженным глазом можно принять за агглютинаты. Во избежание этой ошибки необходимо добавление изотонического раствора NаСl (см.раздел III, д) с последующим покачиванием пластинки что, как правило, уничтожает "монетные столбики";
б) когда исследуемые эритроциты дают феномен ауто- или панагглютинации.
Во избежание этой ошибки необходимо не допускать определение групп крови при температуре ниже 15°С (см.раздел II, а) и обязательно использовать контрольные сыворотки группы АВо(IV) (см.раздел IV, г);
в) при использовании недоброкачественной сыворотки, дающей неспецифическую агглютинацию.
Во избежание этой ошибки следует просматривать ампулы (флаконы со стандартной сывороткой и не использовать ее, если в ней имеются помутнение или признаки высыхания.
г) когда пластинку со смесью эритроцитов и сыворотки не покачивают. В этом случае эритроциты, оседая на дно, могут образовать отдельные скопления, симулирующие агглютинацию.
Во избежание этой ошибки необходимо периодически покачивать пластинку, на которой проводится определение (см. раздел III, г и раздел V, з).
Однако и при правильной оценке реакции в каждой отдельной капле можно сделать неправильное заключение о групповой принадлежности, если спутать порядок расположения стандартов в штативе или на пластинке. Поэтому каждый раз в начале работы по определению групповой принадлежности следует тщательно проверять расположение в штативах пробирок со стандартными эритроцитами, а также всех ампул (флаконов) с сывороткой, их групповую принадлежность, номер серии и дату годности.
Во всех случаях нечеткого или сомнительного результата необходимо повторное определение группы крови при помощи стандартных сывороток других серий. Если результаты также остаются неясными, а определение проводилось только при помощи стандартных сывороток, то следует определить группу крови также и перекрестным способом.
Примечание 1. При определении групповой принадлежности крови больных в лечебных учреждениях могут встретиться трудности, вызванные изменением свойств крови при различных патологических состояниях. Это может выразиться в неспецифической агглютинабельности эритроцитов, например, при аутоиммунной гемолитической анемии, у новорожденных с гемолитической болезнью, у больных циррозом печени, с ожогами, при гнойно-септическом состоянии. При некоторых заболеваниях, например, при лейкозах, наблюдается снижение агглютинабельности эритроцитов, особенно группы А(II), а также снижение активности групповых агглютининов.
В таких случаях определение групповой принадлежности крови больного должно производиться повторно с использованием стандартных сывороток более высокой активности, желательно в лабораторных условиях.
Примечание 2. При использовании для определения групп крови системы АВО моноклональных антител следует руководствоваться специальной инструкцией, которая прилагается к комплектам моноклональных антител при их выдаче.
-----------------------------------------------------T------------------¬ ¦ Изогемагглютинирующие сыворотки группы ¦ Исследуемая ¦ +--------------T------------T------------------------+ кровь ¦ ¦Оальфа бета(I)¦ A-бета(II)¦ B-aльфа(III) ¦ принадлежит ¦ ¦ Анти-(А+В) ¦ Анти-В ¦ Анти-А ¦ к группе ¦ +--------------+------------+------------------------+------------------+ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ О(I) ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ A(II) ¦ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ B(III) ¦ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ +--------------+------------+------------------------+------------------+ ¦ + + + ¦ AB(IV) ¦ ¦ + + + ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Контроль с сывороткой группы АВо(IV) ¦ ¦ L----------------------------------------------------+-------------------
Таблица 1. Оценка результатов определения групп крови при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы. Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие ее.
---------------------------------¬ ---------------------------------¬ ¦ Изогемагглютинирующие ¦ ¦ Изогемагглютинирующие ¦ ¦ сыворотки группы ¦ ¦ сыворотки группы ¦ +-----------T---------T----------+ +-----------T---------T----------+ ¦Oaльфа бета¦Aбета(II)¦ B-aльфа ¦ ¦Oaльфа бета¦Aбета(II)¦ B-aльфа ¦ ¦(A+B) ¦ Анти-В ¦ (III) ¦ ¦(A+B) ¦ Анти-В ¦ (III) ¦ ¦Анти-(А+В) ¦ ¦ Анти-А ¦ ¦Анти-(А+В) ¦ ¦ Анти-А ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ Стандартные эритроциты ¦ ¦ Стандартные эритроциты ¦ +-----------T---------T----------+ +-----------T---------T----------+ ¦ O(I) ¦ A(II) ¦ B(III) ¦ ¦ O(I) ¦ A(II) ¦ B(III) ¦ ¦ - ¦ + ¦ + ¦ ¦ - ¦ - ¦ + ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ Исследуемая кровь группы ¦ ¦ Исследуемая кровь группы ¦ ¦ О(I) ¦ ¦ A(II) ¦ L--------------------------------- L--------------------------------- ---------------------------------¬ ---------------------------------¬ ¦ Изогемагглютинирующие ¦ ¦ Изогемагглютинирующие ¦ ¦ сыворотки группы ¦ ¦ сывороткиы групп ¦ +-----------T---------T----------+ +-----------T---------T----------+ ¦Oaльфа бета¦Aбета(II)¦ B-aльфа ¦ ¦Oaльфа бета¦Aбета(II)¦ B-aльфа ¦ ¦(A+B) ¦ Анти-В ¦ (III) ¦ ¦(A+B) ¦ Анти-В ¦ (III) ¦ ¦Анти-(А+В) ¦ ¦ Анти-А ¦ ¦Анти-(А+В) ¦ ¦ Анти-А ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ + ¦ + ¦ + ¦ ¦ + ¦ + ¦ - ¦ ¦ + ¦ + ¦ + ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ Стандартные эритроциты ¦ ¦ Стандартные эритроциты ¦ +-----------T---------T----------+ +-----------T---------T----------+ ¦ O(I) ¦ A(II) ¦ B(III) ¦ ¦ O(I) ¦ A(II) ¦ B(III) ¦ ¦ - ¦ + ¦ - ¦ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ +-----------+---------+----------+ +-----------+---------+----------+ ¦ Исследуемая кровь группы ¦ ¦ Исследуемая кровь группы ¦ ¦ B(III) ¦ ¦ AB(IV) ¦ L--------------------------------- L---------------------------------
Таблица 2. Оценка результатов определения групп крови перекрестным методом при помощи изогемагглютинирующих сывороток двух серий каждой группы и стандартных эритроцитов.
"Инструкцию по определению групп крови системы АВО при помощи стандартных изогемагглютинирующих сывороток", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/27, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 4
Инструкция *(7)
по применению Цоликлонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических
жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела
моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ) ТУ 9398-205-27575295-94
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Назначение
Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ предназначены для определения групп крови человека системы АВО в прямых реакциях гемагглютинации и применяются взамен или параллельно с поликлональными иммунными сыворотками.
2. Характеристика и основные свойства цоликлонов
анти-А, анти-В и анти-АВ
Моноклональные анти-А и анти-В антитела продуцируются двумя мышиными гибридомами и принадлежат к иммуноглобулинам класса М. Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей-носителей анти-А и анти-В гибридом. Цоликлон анти-АВ представляет собой смесь моноклональных анти-А и анти-В антител. Технология изготовления реагента исключает возможность его контаминации патогенными для человека вирусами.
3. Техника определения групп крови человека
системы АВО с помощью цоликлонов
Определение производится в нативной крови, взятой в консервант; в крови, взятой без консерванта, в том числе взятой из пальца. Используется метод прямой гемагглютинации на плоскости: и на пластине или планшете. Определение группы крови производится в помещении с хорошим освещением при температуре 15 - 25°С.
3.1. Нанесите на планшет или пластину индивидуальными пипетками Цоликлоны анти-А, анти-В и анти-АВ по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями.
3.2. Рядом с каплями антител нанесите по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 - 0,03 мл).
3.3. Смешайте кровь с реагентом.
3.4. Наблюдайте за ходом реакции с Цоликлонами визуально при легком покачивании пластины или планшета в течение трех минут. Агглютинация эритроцитов с Цоликлонами обычно наступает в первые 3-6 секунд, но наблюдение следует вести три минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В.
3.5. Результат реакции в каждой капле может быть положительным или отрицательным. Положительный результат выражается в агглютинации (склеивании) эритроцитов. Агглютинаты видны невооруженным глазом в виде мелких красных агрегатов, быстро сливающихся в крупные хлопья. При отрицательной реакции капля остается равномерно окрашенной в красный цвет, агглютинаты в ней не обнаруживаются.
3.6. Интерпретация результатов реакции агглютинации исследуемой крови с Цоликлонами представлена в таблице.
----------------------------------------T-------------------------------¬ ¦ Результат реакции* ¦ Исследуемая кровь ¦ ¦ с Цоликлоном: ¦ принадлежит к группе** ¦ +---------T---------T-------------------+ ¦ ¦ анти-А ¦ анти-В ¦ анти-АВ ¦ ¦ +---------+---------+-------------------+-------------------------------+ ¦ - ¦ - ¦ - ¦ О(I) ¦ +---------+---------+-------------------+-------------------------------+ ¦ + ¦ - ¦ + ¦ A(II) ¦ +---------+---------+-------------------+-------------------------------+ ¦ - ¦ + ¦ + ¦ B(III) ¦ +---------+---------+-------------------+-------------------------------+ ¦ + ¦ + ¦ + ¦ AB(IV) ¦ L---------+---------+-------------------+--------------------------------
* Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) - отсутствие агглютинации.
** Окончательно АВО принадлежность устанавливается только по результатам перекрестного определения: антигенов А и В на эритроцитах и изогемагглютининов в сыворотке.
4. Контроль специфичности реакции агглютинации
В составе Цоликлонов нет высокомолекулярных добавок, способных вызвать неспецифическую полиагглютинацию эритроцитов, поэтому не требуется проведение контроля с растворителем. При положительном результате реакции агглютинации со всеми тремя Цоликлонами необходимо исключить спонтанную неспецифическую агглютинацию исследуемых эритроцитов. Для этого смешайте на плоскости одну каплю исследуемой крови (эритроцитов) с каплей физиологического раствора. Кровь можно отнести к группе АВ(IV) только при отсутствии агглютинации эритроцитов в физиологическом растворе.
5. Форма выпуска
Цоликлоны выпускаются в жидкой форме во флаконах объемом 5 - 10 мл. Цоликлон анти-А - красного цвета, анти-В - синего и анти-АВ - бесцветный. В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.
6. Хранение
Срок хранения - два года при температуре 2 - 8°С. Вскрытый флакон можно хранить при температуре 2 - 8°С в закрытом виде в течение одного месяца.
7. Рекламация
Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, получение реагента с истекшим сроком годности или недостаточными сведениями.
При составлении рекламации необходимо указать дату получения, номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Необходимо также приложить протокол с результатами проверки реагента. Вместе с рекламацией направляют 2 - 3 невскрытых флакона с Цоликлоном данной серии.
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель.
"Инструкцию по применению Цолициклонов анти-А, анти-В и анти-АВ диагностических жидких для определения групп крови человека системы АВО (антитела моноклональные анти-А, анти-В, анти-АВ)", утвержденную Управлением научных исследований Минздравмедпрома России 17 марта 1995 года, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
---------Составители инструкции: профессор И.Л.Чертков, директор ТОО "Гематолог" Г.Ю.Митерев, научные сотрудники Л.Н.Леменева, Н.И.Оловникова, Е.В.Белкина.
Приложение 5
Инструкция
по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Стандартные сыворотки антирезус служат для определения резус - принадлежности крови людей и приготавливаются из крови лиц, сенсибилизированных к резус-фактору, содержащих в крови активные резус - антитела.
Источники получения сыворотки антирезус
Кровь (плазма) для изготовления сывороток антирезус может быть получена: а) от женщин, сенсибилизированных к резус-фактору во время беременности; б) от больных, перенесших трансфузионные реакции или осложнения, которым производят кровопускание в процессе их лечения (обменные трансфузии, плазмаферез) и от тех же лиц после их излечения; в) от доноров, дающих кровь для переливания больным, в тех (редких) случаях, когда у них обнаружены в крови резус-антитела; г) от лиц, специально иммунизированных антигеном резус. (см.Метод.рекоменд. "Иммунизация доноров для получения сывороток и иммуноглобулина антирезус").
Выявление женщин, сенсибилизированных к резус-антигену
и содержащих в крови резус-антитела
Наиболее часто сенсибилизация к резус-антигену происходит у женщин во время беременности. Выявление таких лиц производится персоналом женских консультаций и родильных домов. Кровь резус-отрицательных женщин исследуют на наличие антител. При выявлении резус-антител сведения о таких лицах передаются в учреждения Службы крови.
Учет лиц, в крови которых содержатся резус-антитела
В тех случаях, когда устанавливается сенсибилизация к резус-антигену, т.е. наличие в крови у женщин резус-антител, таких женщин регистрируют и заводят на них карту "Учета изоимунных лиц". Карты заполняются персоналом родильных домов, в женских консультациях и в учреждениях Службы крови.
Привлечение к донорству лиц, в крови которых содержатся
резус-антитела
У женщин, в крови которых содержатся резус-антитела, может быть взята кровь для изготовления стандартной сыворотки.
Привлечение таких лиц к донорству требует особого подхода. Следует учитывать, что большинство из них перенесло тяжелую психическую травму в связи с болезнью, а иногда и смертью ребенка. Желательно рассказать женщине, что из ее крови будет приготовлена сыворотка-реактив, которую необходимо использовать при лечении детей с таким же заболеванием.
При согласии женщины дать кровь необходимо обследовать состояние ее здоровья и установить возможность и дозы взятия крови.
В дальнейшем, но не ранее, чем через полгода после родов и по окончании периода лактации желательно привлечение женщин, иммунизированных во время беременности, к систематическому донорству, а при падении титра антител - к реиммунизации, в соответствии с "Методическими рекомендациями по иммунизации доноров для получения сыворотки и иммуноглобулина антирезус".
Показатели пригодности крови для изготовления из нее
стандартной сыворотки антирезус
Показателем пригодности крови для приготовления из нее стандартной сыворотки является ее активность, т.е. титр резус-антител.
В виду возможного снижения титра антител при обработке сыворотки следует привлекать к донорству лиц, в крови которых содержатся антитела анти-D с титром, превышающим окончательные требования, предъявляемые к стандартным сывороткам. Для полных антител титр должен быть не ниже, чем 1:32, для неполных антител при исследовании их в непрямой пробе Кумбса - не ниже чем 1:128, а при исследовании реакцией с применением желатина в пробирках или реакцией в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:64.
Исходный титр резус-антител при изготовлении стандартного универсального реагента должен быть не ниже 1:32.
Методы и дозы взятия крови
Взятие крови от лиц, сенсибилизированных к резус-антигену предыдущими беременностями или трансфузиями крови, а также от искусственно иммунизированных доноров, состояние здоровья которых соответствует требованиям инструкции, предъявляемым к донорам, дающим кровь для переливания больным, допускается в дозах, предусмотренных этой инструкцией.
Плазму, содержащую резус-антитела, рекомендуется получать также методом плазмафереза, однако только вне периода беременности.
Оплата на усиление питания лицам, из крови которых изготавливается сыворотка антирезус, при любом методе взятия крови и последующего отделения сыворотки или плазмы, производится в тройном размере.
Первичная обработка сыворотки и плазмы
При получении плазмы из крови донора методом плазмафереза, плазма не позже, чем через 2-3 дня должна быть дефибринирована. Для этого плазму переливают из пластикатного мешка во флакон, добавляют в нее 20% раствор хлорида кальция из расчета 3 мл на 100 мл плазмы и содержимое флакона тщательно перемешивают. Через несколько минут после этого, а затем еще раз через 30 минут, флакон с плазмой встряхивают для отделения свертка от стенок флакона и оставляют на 2 часа при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют борной кислотой из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азидом натрия - 1 г на 1 л.
Если кровь берут обычным путем в сухой флакон, то через несколько минут после взятия крови, а затем еще раз через 30 минут, флакон встряхивают для отделения свертка от стенок и оставляют на 2 ч при комнатной температуре, после чего помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку отсасывают от свертка в другой флакон и консервируют. При высоком титре резус-антител можно получить дополнительное количество сыворотки антирезус путем приготовления смывов со свертка. Для этого сверток измельчают (разрезают на много частей) и заливают его до половины объема изотоническим раствором NаСl или сывороткой группы АВ(IV) с высокими конглютинирующими свойствами, стандартным разводителем или альбумином.
Флакон со свертком, залитым жидкостью, плотно закрывают пробкой и несколько раз переворачивают для того, чтобы лучше вымыть из свертка сыворотку антирезус, а затем помещают в холодильник при температуре 4-8°С. На следующий день сыворотку-смыв сливают в другой сосуд и оставляют в холодильнике до полного оседания эритроцитов, после чего переливают в другой сосуд и полученный смыв исследуют на активность резус-антител. Если титр соответствует требованиям, изложенным в пункте 11, смыв соединяют с первоначально полученной сывороткой или обрабатывают далее отдельно, предварительно добавляя в него борную кислоту из расчета 2-3 г на 100 мл сыворотки или азид натрия - 1 г на 1 л. Приготовление смыва можно повторить. Изотонический раствор NаСl применяется для смывов в тех случаях, когда предполагается последующее использование сыворотки антирезус реакцией агглютинации в солевой среде (в маленьких пробирках) или реакцией конглютинации с применением желатина или полиглюкина.
После такой первичной обработки сыворотку хранят при 4-8°С не менее 2-3 недель и затем приступают к дальнейшим исследованиям.
Исследование сыворотки
Исследование сыворотки следует производить через 2-3 недели после ее заготовки и консервирования ввиду того, что в этот период может происходить снижение титра антител. Исследование начинают с проверки групповой принадлежности сыворотки по системе АВО. Полученные результаты сверяют с паспортными записями на флаконе с сывороткой. Следует учесть, что если исследуется смыв со свертка, полученный сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем группы АВ(IV), то может произойти нейтрализация групповых антител альфа и бета. Если это будет установлено, то делают соответствующие изменения в паспортных записях. Далее определяют в сыворотке присутствие полных и неполных антител с помощью методов, описанных в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител".
Для испытания применяется не менее трех образцов стандартных эритроцитов одноименной с испытуемой сывороткой группы или группы О(I), содержащих в том или ином сочетании три антигена резус: D, С и Е, а также два образца резус-отрицательных (ссddее) эритроцитов. Положительный результат с резус-положительными эритроцитами и отрицательный с резус-отрицательными подтверждает наличие в сыворотке резус - антител. После этого сыворотку титруют тем же методом, которым в ней были выявлены антитела. Например, если сыворотка дала положительный результат в солевой среде, ее титруют в солевой среде; если сыворотка дала положительный результат в непрямой пробе Кумбса или в реакции с применением желатина, ее титруют, используя эти методы; если сыворотка оказалась активной при использовании обоих методов, она титруется также с помощью двух методов (методы титрования см. в "Инструкции по исследованию сыворотки на наличие резус-антител").
Сыворотку считают пригодной для дальнейшей обработки и исследования, если в ней выявляют антитела любым методом и если при этом антитела достаточно активны. Активность антител определяется их титром, который на этом этапе исследования должен быть для полных антител не ниже 1:16, а для неполных антител в непрямой пробе Кумбса не ниже 1:64, реакциями с применением желатина или полиглюкина, и в сывороточной среде на плоскости - не ниже 1:32.
Сыворотки сохраняют в холодильнике при 4-8°С еще не менее 2 недель, после чего повторно титруют.
Примечание: в тех случаях, когда сыворотка антирезус принадлежит к группе О-альфа бета(I), А-бета(II) или В-альфа(III) для удобства последующего использования ее рекомендуется абсорбировать, т.е. удалить из нее групповые агглютинины, сделав таким образом ее универсальной.
Если в сыворотке присутствуют слабые антитела анти-С или анти-Е, их необходимо также удалить из сыворотки путем абсорбции.
После абсорбции (нейтрализации) сыворотку антирезус вновь исследуют и титруют как сказано выше.
Способы удаления или нейтрализации антител см. в Методических рекомендациях "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности".
Повторное титрование сыворотки
Повторное титрование сыворотки производят, используя метод, который дал положительный результат при первом исследовании сыворотки. Если титр антител сохранился или снизился не более чем на одну ступень, но так, что все же остался не ниже цифр, указанных в пункте 8, сыворотку можно подвергнуть стандартизации.
Стандартизация сыворотки антирезус
Стандартизация заключается в исследовании специфичности антител и в определении пригодности ее для практического использования. Для стандартизации сыворотку исследуют с помощью того же метода, в котором оказались активными содержащиеся в сыворотке антитела. Испытание ведется со стандартными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), содержащими различные антигены резус, в том числе каждый из этих антигенов в отдельности: ссDее, Ссddее и ссddЕе, и резус-отрицательными - ссddее. В число резус-отрицательных включают образцы эритроцитов, содержащих и не содержащих факторов Даффи (Fу) и Келл (К). Если при стандартизации сыворотка дает положительный результат со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, независимо от их антигенной структуры, и отрицательный результат с эритроцитами Ссddее, ссddЕе и резус-отрицательными - ссddее, то значит в сыворотке содержатся резус-антитела анти-D. Если в сыворотке таким образом выявлены антитела cпецифичности анти-D, то ее титруют при использовании того же метода.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат с некоторыми образцами резус-положительных эритроцитов и с эритроцитами Ссddee или ссddEе, но дает отрицательный результат с эритроцитами ссDее и с резус-отрицательными - ссddее, то это значит, что в сыворотке содержатся резус-антитела анти-С или анти-Е.
Антитела анти-С и анти-Е также титруют, используя метод, при помощи которого они были выявлены.
Если сыворотка при стандартизации дает положительный результат одновременно со всеми образцами резус-положительных эритроцитов, а также с эритроцитами Ссddeе и ссddEe, но отрицательный результат со всеми резус-отрицательными эритроцитами ссddее, то это значит, что сыворотка содержит антитела соответственно к двум или трем антигенам резус, т.е. анти-D+С, анти-D+Е или анти-D+С+Е.
Каждое из антител титруют отдельно теми методами, при использовании которых они оказались активными.
Следует отметить, что различные резус-антитела в одной и той же сыворотке бывают полными и неполными и поэтому могут быть соответственно активными в той или иной среде. В этих случаях их титрование следует проводить, используя разные методы.
Если исследуемая сыворотка дала положительный результат избирательно среди резус-отрицательных образцов, это значит, что в ней содержатся другие антитела, например, анти-Даффи или анти-Келл.
Исследование и обработку таких сывороток см. в "Инструкции по изготовлению сывороток редких групп".
Окончательное заключение о пригодности сыворотки
Сыворотка считается стандартной и пригодной для практического использования, если она содержит одно или несколько резус-антител в любой форме (полные или неполные) с титром для анти-D: в солевой среде не ниже 1:16; в непрямой пробе Кумбса - не ниже 1:64; для реакции с применением желатина или полиглюкина.
Ввиду редкости антител анти-С и анти-Е допускается использование таких сывороток с более низким титром при условии хорошо выраженного положительного результата. Сыворотки, отвечающие этим требованиям, считаются стандартными сыворотками данной специфичности.
Назначение сыворотки антирезус
Сыворотка антирезус, признанная стандартной, может быть использована в зависимости от формы установленных в ней антител: реакцией агглютинации в солевой среде, реакцией с применением желатина, реакцией в сывороточной среде на плоскости.
Кроме того сыворотка, содержащая неполные резус-антитела, может быть использована для приготовления стандартного универсального реагента антирезус с применением 33% раствора полиглюкина. Для этого требуется ее дальнейшая обработка (см. п.16).
Во всех случаях сыворотка и реагент, предназначенные для практического использования, должны быть расфасованы и паспортизированы.
Розлив и паспортизация стандартных сывороток антирезус
После стандартизации и заключения о пригодности сыворотки фильтруют и разливают в ампулы или в маленькие флаконы по 2-5 мл, в зависимости от потребности. На флаконы (ампулы) наклеивают этикетки с наименованием учреждения-изготовителя, номера серии, обозначения группы крови по системе АВО, специфичности, формы антител антирезус и срока годности.
Хранение и срок годности стандартной сыворотки антирезус
Расфасованные стандартные сыворотки антирезус хранят в холодильнике при 4-8°С или в замороженном состоянии при - 15°С и ниже.
При хранении в замороженном состоянии сыворотка не изменяет свойств в течение 2 лет.
При размораживании или хранении ее при 4-8°С срок годности устанавливают 4 мес.
Активность резус-антител в большинстве случаев сохраняется и дольше. Поэтому по истечении срока годности сыворотки могут быть проверены (см. п.10) и при сохранении их специфичности и титра срок годности продлевают: для сыворотки, хранящейся в замороженном состоянии, - еще на 1 год, а для сыворотки, хранившейся при 4-8°С, - на 2 месяца.
------------------------¬ ------------------------¬
¦Наименование учреждения¦ ¦Наименование учреждения¦
¦ изготовителя ¦ ¦ изготовителя ¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦Сыворотка антирезус ¦ ¦Сыворотка антирезус ¦
L------------------------ L------------------------
-------------------------------¬ -------------------------------¬
¦анти-....... неполные антитела¦ ¦анти-....... полные антитела¦
¦для метода ...................¦ ¦для метода ...................¦
¦Группа крови .................¦ ¦Группа крови .................¦
¦Серия........... ........ мл¦ ¦Серия........... ........ мл¦
¦ ¦ ¦ ¦
¦Годна до .................. ¦ ¦Годна до .................. ¦
L------------------------------- L-------------------------------
Рисунок 1. Форма этикеток для стандартных сывороток антирезус.
На этикетках группы А(II), В(III) и АВ(IV) наносят по диагонали цветные полосы:
для сыворотки группы А(II) - синие;
для сыворотки группы В(III) - красныe;
для группы АВ(IV) и специально приготовленной - универсальной - желтые.
Выдача стандартной сыворотки антирезус
При выдаче стандартной сыворотки антирезус к ней необходимо приложить инструкцию по использованию. Для сыворотки антирезус это особенно важно, так как сыворотки, содержащие антитела, разные по форме (полные и неполные) и приготовленные для разных методов исследования, активны только при применении определенного метода и будут неактивными или неспецифическими при неправильном их использовании. Инструкции по использованию для каждого метода см. дополнения 1, 2, 3.
Изготовление стандартного универсального реагента антирезус
для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева
Стандартный универсальный реагент антирезус пригоден для определения резус-фактора крови, независимо от ее групповой принадлежности по системе АВО. Реагент готовят из сывороток, содержащих неполные резус-антитела, предварительно обработанных, исследованных и признанных пригодными, как стандартные (см.п.п.6-11).
Для изготовления реагента отбирают сыворотки группы АВ(IV) или другой группы, но освобожденные от групповых агглютининов альфа и бета путем удаления или нейтрализации (см. Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус-D антител другой специфичности").
Для изготовления реагента пригодны сыворотки антирезус с титром не ниже, чем 1:32. Если исходные сыворотки имеют более высокий титр, допускается их разведение до титра 1:32 изотоническим раствором NаСl, сывороткой группы АВ(IV) или стандартным универсальным разводителем (см. Методические рекомендации "Приготовление сыворотки - разводителя и стандартного разводителя").
Титрование сывороток производят с применением 33% раствора полиглюкина.
В штатив устанавливают 10 пробирок с обозначением 1:2, 1:4 и т.д. до 1:1024. Во все пробирки вводят по 2 капли изотонического раствора NаСl.
Затем в первую пробирку вводят той же пипеткой 2 капли исследуемой сыворотки антирезус, из первой пробирки, после перемешивания содержимого переносят 2 капли во вторую, из третьей - в четвертую и т.д. до последней, из которой 2 капли удаляют.
Затем во все пробирки добавляют по 1 капле резус-положительных эритроцитов или их смеси и по 1 капле 33% раствора полиглюкина.
Примечание: смесь эритроцитов готовят из крови 4-6 доноров группы О(I) резус - положительной, взятой не более, чем за 2-3 дня.
Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого, затем наклоняют почти до горизонтали и в таком положении медленно поворачивают по оси так, чтобы содержимое растеклось по стенкам пробирки. Такой контакт сыворотки с эритроцитами при поворачивании пробирок продолжают 3 минуты.
Через 3-5 минут во все пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1-2-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!)
Результат наблюдают в проходящем свете невооруженным глазом или через лупу.
Оценку результата производят по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов в виде комочков или хлопьев на фоне полностью или частично обесцвеченной жидкости.
Последнее разведение, в котором имеется агглютинация эритроцитов, принимают за титр исследуемой сыворотки.
Установив, что титр резус-антител в данном методе не ниже 1:32, переходят к дальнейшему исследованию, для чего готовят пробный образец реагента.
Изготовление пробного образца реагента антирезус
К 2 объемам сыворотки антирезус с неполными антителами добавляют 1 объем 33% раствора полиглюкина, тщательно перемешивают и далее проводят исследование в отношении специфичности и активности.
Исследование на специфичность и активность
Пробный образец реагента исследуют с 2-3 образцами резус-положительных эритроцитов, а также с резус-отрицательными ссddеe группы O(I), А(II) и В(III). Кроме того, в исследование включают эритроциты генотипа Ссddее и ссddЕe. Среди резус-отрицательных должны быть образцы положительные и отрицательные по факторам Даффи(Fу) и Келл(К).
Для исследования устанавливают ряд пробирок по числу образцов эритроцитов, пробирки маркируют. На дно пробирок помещают по 2 капли исследуемого реагента и затем в соответствии с маркировкой в пробирки вводят по 1 капле эритроцитов. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, затем пробирки наклоняют почти до горизонтального положения, медленно поворачивают и т.д., как сказано выше.
Трактовка результата
Результат учитывают по отсутствию или наличию агглютинации эритроцитов и скорости ее наступления в каждой пробирке.
Специфичность оценивают по отсутствию агглютинации с D-отрицательными эритроцитами различного фенотипа в каждой отдельной пробирке.
Если агглютинация произошла во всех пробирках с резус-положительными образцами, а со всеми резус-отрицательными образцами и образцами Ссddeе и ссddЕе - реакция отрицательная, пробный образец считают специфическим.
Активность пробного образца можно оценивать одновременно с оценкой специфичности.
Если агглютинация резус-положительных эритроцитов проявилась при поворачивании наклоненной пробирки в течение 1-й минуты и через 3 минуты после добавления изотонического раствора NаСl агглютинаты образуют крупные хлопья на фоне полностью просветленной жидкости и при этом титр антител, определенный на предыдущем этапе исследования не ниже 1:32, реагент считают пригодным для практического использования.
Изготовление полного объема (серии)
стандартного универсального реагента антирезус
После заключения о пригодности пробного образца можно готовить стандартный универсальный реагент в полном объеме, исходя из потребности. Изготовленный реагент вновь контролируют теми же методами, т.е. титруют и исследуют на специфичность и активность и делают заключение о его пригодности.
После этого реагент фильтруют, разливают по 2-5 мл во флаконы или ампулы, которые тщательно закупоривают (запаивают) и наклеивают на них этикетки с указанием учреждения, изготовившего реагент, название реагента, специфичности, номера серии и срока годности.
---------------------------------------¬
¦ Наименование ¦
¦ учреждения-изготовителя ¦
+--------------------------------------+
¦ Универсальный реагент антирезус ¦
¦ анти - ......................... ¦
¦ для метода в пробирках без подогрева ¦
¦ ¦
¦ Серия ............. ........мл ¦
¦ ¦
¦ Годен до .................. ¦
L---------------------------------------
Рисунок 2. Форма этикетки для стандартного универсального реагента антирезус.
Хранение и срок годности
Реагент хранят в холодильнике при 4-8°С.
Срок годности - 6 месяцев. Активность и специфичность реагента контролируют 1 раз в месяц в лаборатории, его изготовившей.
Выдача стандартного универсального реагента антирезус
Реагент антирезус выдается в другие учреждения в комплекте с 33% раствором полюглюкина и с инструкцией по использованию (см. дополнение 2).
Регистрация работы по изготовлению сыворотки и реагента антирезус
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6