Приказ Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2 "Об утверждении инструкций по иммуносерологии"
Архив. Правовая библиотека. Текст документа по состоянию на 25 сентября 2006 года
Страница 3
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6
Все этапы работы по изготовлению сывороток, предназначенных для разных методов определения резус-принадлежности, а также реагента антирезус, регистрируются в "Журнале регистрации материала, поступившего для изготовления стандартной сыворотки антирезус" и в "Журнале регистрации изготовленной стандартной сыворотки антирезус".
Дополнение 1
Инструкция
по использованию стандартной сыворотки антирезус для определения
резус-принадлежности реакцией с применением желатина.
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция с применением желатина пригодна для работы с сыворотками, содержащими неполные резус-антитела.
Общие замечания
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки антирезус по системе АВО.
Сывороткой антирезус или группы АВ(IV) специально приготовленной - универсальной определяют резус-принадлежность в эритроцитах любой группы по системе АВО. Сывороткой антирезус группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы O(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой антирезус группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что и исследуемая кровь и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов
Кровь для исследования берут в количестве 5 мл в обычную пробирку без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество свободных эритроцитов, которые и следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия (0,25 мл на 1 мл крови) или другим стабилизатором. В этом случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить доверху изотонический раствор NаСl, содержимое ее перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты используют для исследования. Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника реакции
а) В штатив устанавливают два ряда центрифужных пробирок объемом не менее 10 мл по количеству исследуемых образцов эритроцитов и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На двух пробирках каждого ряда надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
б) В одинаково обозначенные пробирки вводят согласно маркировке по одной капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, в контрольные пробирки: - по одной капле (0,05 мл) стандартных резус-положительных эритроцитов и по 1 капле (0,05 мл) стандартных резус-отрицательных эритроцитов.
в) Во все пробирки добавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения в теплой воде (46-48°С). Перед употреблением желатин следует просмотреть. При помутнении или появлении хлопьев, а также при потере свойств застудневать при 4-8°С желатин непригоден.
г) Во все пробирки 1-го ряда добавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.
2-ой ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.
д) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помещают в водяную баню при 46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат при той же температуре на 30-45 минут.
е) По извлечении пробирок из водяной бани или термостата в них доливают 8-10 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1-2-краткого перевертывания пробирок.
Трактовка результатов
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков на прозрачном, почти обесцвеченном, фоне жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная слегка опалесцирующая жидкость.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, считают резуc - положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также после просмотра результатов во втором ряду. В пробирках второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно. Наличие агглютинации во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, напр., из-за аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применить сыворотку антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации или предварительно отмыть эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl, для элюирования с них аутоантител.
Примечание.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабо выраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сыворотки антирезус высокой активности и, по возможности, сывороткой с полными антителами.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус - отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительное исследование сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус - отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
w
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е и С производится
сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти
антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных
сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа. Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение 2
Инструкция
по использованию стандартного универсального реагента
для определения резус-принадлежности в пробирках без подогрева
(Прилагается при выдаче реагента)
Стандартный универсальный реагент антирезус не содержит групповых агглютининов альфа и бета и поэтому может быть использован для определения резус-антигена D в эритроцитах любой группы системы АВО. Для контроля активности и специфичности реагента антирезус необходимо одновременно с основным исследованием ставить контроль, используя стандартные резус-положительные и стандартные резус - отрицательные эритроциты.
Предварительной обработки исследуемой крови и стандартных эритроцитов не требуется. Может быть использована кровь, взятая непосредственно из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови, взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника реакции
а) В штатив устанавливают 2 ряда пробирок по числу исследуемых эритроцитов в каждом ряду и по 2 пробирки для контрольных исследований. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
б) Во все пробирки 1-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки 2-го ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NaCl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора полиглюкина.
2-й ряд служит контролем для исключения возможной неспецифической агглютинации исследуемых эритроцитов, например за счет аутоантител.
в) В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови (эритроцитов) и стандартные резус-положительные (Rh+) и резус-отрицательные (rh-) эритроциты.
г) Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по стенкам пробирки. Такое размазывание крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной.
Как правило, агглютинация эритроцитов наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивости комплекса антиген+антитело и четко выраженной реакции, а также ввиду возможности замедленной реакции при слабовыраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 3 минут.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 2-3-кратного переворачивания пробирок (не встряхивать!).
Трактовка результатов.
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости, исследуемую кровь относят к резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь можно считать резус-отрицательной (rh-).
Однако эти результаты можно учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами и отрицательной - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, а также после просмотра результатов во 2-м (контрольном) ряду. Во всех пробирках контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации эритроцитов во втором (контрольном) ряду указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов, например, за счет аутоантител и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный.
Для определения резус-принадлежности в таких случаях следует применять другую активную сыворотку антирезус и сыворотку антирезус с полными антителами или предварительно отмытые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител.
Примечание.
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабовыраженную реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими сериями сывороток антирезус высокой активности и параллельно сывороткой антирезус с полными антителами в реакции солевой агглютинации.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их на резус-положительных и резус-отрицательных по реагенту анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е. В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус С, Е, с, е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус - антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
Дополнение 3
Инструкция
по использованию стандартной сыворотки антирезус анти-D для определения
резус-принадлежности реакцией агглютинации в солевой среде
(Прилагается при выдаче сыворотки)
Реакция агглютинации в солевой среде пригодна для работы с сывороткой, содержащей полные резус-антитела.
Общие замечания
Определение резус-фактора следует производить двумя сериями стандартных сывороток антирезус. В настоящей инструкции описывается определение двумя сериями сыворотки с использованием одной и той же методики - агглютинации в солевой среде.
При определении резус-принадлежности необходимо учитывать групповую специфичность сыворотки по системе АВО.
Сыворотка группы АВ(IV) и специально приготовленная - универсальная - предназначена для определения резус-принадлежности крови любой группы по системе АВО.
Сывороткой группы O(I) определяют резус-принадлежность только в эритроцитах группы О(I), сывороткой группы А(II) - в эритроцитах группы O(I) и А(II) и сывороткой группы В(III) - в эритроцитах группы O(I) и В(III).
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяют стандартные резус-положительные эритроциты группы O(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и стандартные резус-отрицательные эритроциты обязательно той же группы, что и исследуемая кровь.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия или любого другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь и без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают, как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего одну каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NаСl. Такую взвесь употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника реакции
а) в штатив устанавливают два ряда пробирок высотой 2-2,5 см с внутренним диаметром 0,5-0,6 см и с гладким дном округлой формы в каждом ряду по числу исследуемых эритроцитов и по две пробирки для контрольных исследований. Предварительно штатив накрывают листом бумаги, в котором слегка накалывают отверстия, сквозь которые устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется. Можно использовать планшет для иммунологических реакций, имеющий лунки с круглым дном.
б) во все пробирки (лунки) 1-го ряда вносят по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) 2-го ряда - по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и в оба ряда добавляют по 1 капле изотонического раствора NаСl;
в) в соответственно обозначенные пары пробирок (лунок) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси исследуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси стандартных резус-положительных эритроцитов и по одной капле взвеси стандартных резус-отрицательных эритроцитов;
г) содержимое пробирок (лунок) тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37°С на 1 час. (Можно затем оставить планшет при комнатной температуре еще на 1 - 2 часа до учета результатов).
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов
Пробирки (планшеты) рассматривают по продольной оси над источником света закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномерным слоем без шероховатости и неровностей, иногда с небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.
Диаметр при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D - резус - положительные (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D, - резус-отрицательные (rh-).
Однако результаты можно учитывать как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус - отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
Рисунок 3. Осадок эритроцитов при определении резус-принадлежности.
Примечания:
1. Изредка встречаются образцы эритроцитов, дающие слабовыраженную
реакцию. В этих случаях следует повторно исследовать их несколькими
v
сериями сыворотки антирезус высокой активности. Антиген крови D в
реакции солевой агглютинации не выявляется.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е, фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
2. При определении резус-принадлежности крови доноров недостаточно разделения их только на резус-положительных и резус-отрицательных по сыворотке анти-D, а необходимо дополнительно исследовать сыворотками, содержащими антитела анти-С и анти-Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых не содержит ни одного из этих антигенов, т.е. фенотипа ссddее.
3. Определение антигенов системы резус - С, Е, с и е производится сыворотками, содержащими антитела соответствующей специфичности. Эти антитела могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в различных сочетаниях, в том числе и с анти-D.
Эти исследования производятся теми же методами, что и определение резус-антигена D. В качестве контролей используются эритроциты соответствующего фенотипа.
Подробности о технике реакции, оценке результатов, мерах предупреждения возможных ошибок см. в "Инструкции по определению резус-принадлежности крови".
"Инструкцию по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/28, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 6
Инструкция
по удалению из сыворотки антирезус антител другой специфичности
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Общие сведения
В практической работе по определению резус-принадлежности крови наибольшее удобство представляет использование сывороток антирезус группы крови АВ(IV), не содержащих групповых агглютининов альфа и бета. Такие сыворотки являются универсальными, так как позволяют определять резус-принадлежность в крови любой группы по системе АВО.
Сыворотки антирезус, принадлежащие к группам О(I), А(II) и В(III), также могут быть превращены в универсальные путем абсорбции или нейтрализации в них групповых агглютининов альфа и бета.
Помимо групповых агглютининов использованию сыворотки антирезус мешают также имеющиеся в отдельных случаях изоиммунные антитела другой специфичности, чаше всего анти-С и анти-Е. Если эти антитела имеют низкий титр, они могут быть удалены при помощи абсорбции или путем разведения сыворотки.
Использование универсальных сывороток антирезус упрощает работу, повышает эффективность лабораторной службы и исключает получение ошибочных результатов из-за несоответствия группы сыворотки антирезус и исследуемых эритроцитов. Для освобождения сыворотки антирезус от агглютининов альфа, бета и от антител анти-С и анти-Е можно применять разные способы:
а) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета соответствующим групповым веществом, содержащимся в амниотической жидкости (см.п.1)
б) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета естественным групповым веществом А и В (субстанция Витебского) (см. п.2);
в) абсорбцию групповых агглютининов aльфа и бета резус - отрицательными эритроцитами, находящимися в свертках крови после снятия с них сыворотки (см. п.3);
г) нейтрализацию групповых агглютининов альфа и бета путем разведения сыворотки (см. п.4);
д) абсорбцию антител анти-С и анти-Е эритроцитами этой специфичности (см. п.5);
е) нейтрализацию антител анти-С и анти-Е путем разведения сыворотки (см. п.6).
1. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета при
помощи амниотической жидкости *(7)
Амниотическая жидкость содержит растворенную групповую субстанцию, соответствующую группе крови плода. Она может быть использована как в нативном виде, так и предварительно высушенная и затем растворенная дистиллированной водой (получение и обработку амниотической жидкости см. п.8).
Для нейтрализации агглютининов альфа и бета в сыворотке антирезус группы O-aльфа бета(I) используют амниотическую жидкость группы АB(IV) или смесь ... образцов амниотической жидкости групп А(II) и В(III). Для нейтрализации агглютининов бета в сыворотке группы А-бета(II) используют амниотическую жидкость группы В альфа (III). Для нейтрализации агглютининов альфа в сыворотке антирезус группы Ва(III) используют амниотическую жидкость группы А(II).
Для полного истощения групповых агглютининов в исходной сыворотке антирезус проводят подбор оптимального соотношения амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки антирезус, для чего:
- в штатив устанавливают пять пробирок с обозначениями 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6,
во все пробирки вносят по 2 капли амниотической жидкости - нативной или растворенной после высушивания;
- в первую пробирку добавляют 4 капли нейтрализуемой сыворотки, во вторую - 6 капель, в третью - 8 капель, в четвертую - 10 капель, в пятую - 12 капель;
- содержимое пробирок перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре;
- после 10-ти минутной экспозиции смесь из каждой пробирки контролируют на плоскости на полноту нейтрализации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, содержащими антиген, соответствующий нейтрализуемым агглютининам;
- последнее разведение, в котором отсутствует агглютинация (время наблюдения 5 минут) принимается за оптимальное соотношение амниотической жидкости и нейтрализуемой сыворотки;
- если агглютинация отсутствует во всех разведениях, готовят разведения: 1:7, 1:8, 1:9 и продолжают исследование, как сказано выше;
- после того как выбрано оптимальное соотношение, к основному объему сыворотки антирезус добавляют соответствующее количество амниотической жидкости и перемешивают их. Через 10-20 мин. после перемешивания вновь проверяют сыворотку на полноту абсорбции на плоскости с 6-8 образцами резус - отрицательных эритроцитов группы А(II) и В(III).
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
Примечание:
В целях упрощения получения универсальных сывороток из сывороток антирезус группы А-бета(II) и В-aльфа(III) их можно предварительно смешивать, что позволяет нейтрализовать одномоментно агглютинины альфа и бета амниотической жидкостью группы АВ(IV) или смесью амниотической жидкости группы А(II) и группы В(III). Предварительное смешивание сыворотки противоположных групп целесообразно еще и потому, что при этом происходит частичная взаимная нейтрализиция групповых агглютининов, что снижает количество амниотической жидкости, необходимое для полной нейтрализации, а, следовательно, снижается степень разведения абсорбируемой сыворотки.
Использование высушенной амниотической жидкости
При низком титре сыворотки антирезус, ограничивающем ее разведение, для нейтрализации агглютининов целесообразно использовать сухой порошок. К нейтрализации приступают так же - с определения оптимального соотношения сыворотки антирезус и сухого порошка, полученного из амниотической жидкости, для чего:
- в штатив устанавливают четыре пронумерованные пробирки, в которые вносят по 0,5 мл сыворотки антирезус;
- в первую пробирку добавляют 2 мг высушенной амниотической жидкости, во вторую - 4 мг, в третью - 8 мг и в четвертую - 16 мг. Содержимое пробирок перемешивают до полного растворения порошка и оставляют при комнатной температуре;
- через 10 минут проводят испытание на плоскости на полноту нейтрализации с эритроцитами групп А(II) и В(III) и выбирают оптимальное соотношение ингредиентов;
- выбранное соотношение используют для изготовления основного объема сыворотки;
- далее сыворотку исследуют и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
2. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета естественными
групповыми веществами специфичности А и В (субстанция Витебского)
Групповые специфические вещества А и В являются высокомолекулярными полисахаридами, приготавливаются в производственных условиях из слизистой оболочки свиных и лошадиных желудков путем их ферментативного переваривания с последующим осаждением и очисткой органическими растворителями. Количество группового специфического вещества, необходимого для нейтрализации антител в сыворотке, зависит от активности вещества. Для нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке антирезус добавляют групповое специфическое вещество из расчета:
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы О(I) - 0,1 г группового вещества А и 0,1 г - группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы А(II) - 0,1 г группового вещества В;
- к 1000 мл сыворотки антирезус группы В(III) - 0,1 г группового вещества А.
Для растворения группового вещества необходимое его количество сначала растирается стеклянной палочкой в пробирке или на часовом стекле с небольшим количеством (1 мл) сыворотки антирезус, подогретой до 37°С, затем это групповое вещество переносят в общее количество сыворотки антирезус, тщательно многократно смывая его сывороткой со стекла. Сыворотку антирезус перемешивают с групповым веществом и помещают в термостат на 3 часа, перемешивая каждые 30 минут.
После этого сыворотку помещают в холодильник при 4°С не менее, чем на трое суток, а затем исследуют на пластинке на содержание групповых агглютининов с 6-8 образцами резус-отрицательной крови группы А(II) и В(III).
Отсутствие агглютинации означает, что групповые агглютинины полностью нейтрализованы. Наличие агглютинации означает неполную нейтрализацию групповых агглютининов. В случае неполной нейтрализации групповых агглютининов к сыворотке вновь добавляют такое же или большее (до 0,5 г) количество группового вещества и вся процедура повторяется.
При полной нейтрализации групповых агглютининов сыворотку исследуют и обрабатывают далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
3. Абсорбция групповых агглютининов резус-отрицательными
эритроцитами на свертках крови группы АВ(IV)
Неотмытые свертки крови группы АB(IV), оставшиеся после отсасывания сыворотки антирезус, допустимо хранить при 4-8°С в течение 1-2 суток.
Для абсорбции охлажденный сверток измельчают при помощи стеклянной палочки и добавляют к нему также охлажденную сыворотку антирезус в количестве 1/6-1/3 объема по отношению к объему, занимаемому измельченным свертком (к 300 мл свертка приливают 50-100 мл абсорбируемой сыворотки, в зависимости от активности групповых антител). Сыворотку тщательно смешанную со свертком оставляют на 18-20 часов при 4-8°С, после чего отделяют от свертка путем центрифугирования.
Далее сыворотку проверяют на плоскости с 6-8 образцами резус отрицательных эритроцитов и в случае полной абсорбции групповых агглютининов обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
4. Нейтрализация групповых агглютининов альфа и бета
при помощи разведения сыворотки
Для нейтрализации сыворотку антирезус разводят изотоническим раствором NаСl специально подобранной сывороткой группы АВ(IV) или стандартным разводителем.
Нейтрализация групповых антител при помощи разведения возможна только лишь при большом различии титра групповых и резус - антител.
Например, если титр групповых антител 1:8, сыворотку следует развести не менее чем в 16 раз, что возможно только в том случае, если титр резус-антител в ней после разведения сохранится не ниже требований, предъявляемых к стандартной сыворотке антирезус.
В процессе работы в начале следует приготовить пробные разведения сыворотки антирезус и исследовать титр резус-антител, а также степень нейтрализации групповых антител с 6-8 образцами резус-отрицательных эритроцитов группы А(II) и B(III).
При сохранении достаточного титра резус - антител и полноте абсорбции групповых антител, разводят основной объем сыворотки антирезус и далее исследуют ее и обрабатывают в соответствии с "Инструкцией по изготовлению сывороток и реагента антирезус".
5. Удаление из сыворотки антирезус сопутствующих
антител анти-С и анти-Е
Если на какой-либо стадии обработки сыворотки антирезус-D выяснится, что в ней содержатся еще и другие антитела антирезус, последние могут быть удалены путем абсорбции или разведения сыворотки.
Абсорбция производится трижды отмытыми эритроцитами, взятыми приблизительно в половинном объеме по отношению к сыворотке. Если в сыворотке имеется примесь антител анти-С, то для абсорбции применяются эритроциты фенотипа Ссddее, а если имеется примесь анти-Е, то эритроциты фенотипа ссddЕе. Абсорбция проводится в течение 2-3 час. при температуре 37°С при помешивании с последующей проверкой сыворотки на специфичность и активность. Если сопутствующие антитела не удалились, сорбцию можно повторить.
Разведение сыворотки антирезус для удаления сопутствующих антител можно проводить при титре антител анти-D не ниже чем 1:128-1:256 и титре сопутствующих антител не выше 1:2.
Сыворотку антирезус разводят изотоническим растворов NaCl, сывороткой-разводителем или стандартным разводителем.
В начале следует делать пробные порции, которые исследовать на полноту нейтрализации сопутствующих антител и на сохранность достаточного титра резус - антител-D. При положительном результате разводят основной объем сыворотки. Как после абсорбции так и после разведения основного объема сыворотки, ее вновь обрабатывают и исследуют далее в соответствии с "Инструкцией по изготовлению стандартных сывороток и реагента антирезус".
6. Получение и обработка амниотической жидкости для использования
ее при изготовлении сывороток антирезус
Амниотическую жидкость собирают в родильных домах от каждой роженицы отдельно в чистые флаконы. От одной роженицы может быть получено от 100 до 1500 мл. На этикетке флакона указывают фамилию роженицы, дату взятия, количество и, по возможности, группу крови новорожденного.
Групповая принадлежность амниотической жидкости соответствует группе крови новорожденного.
Оплата за сбор амниотической жидкости производится учреждениями службы крови аналогично оплате за ретроплацентарную кровь из средств на заготовку крови.
Подготовка амниотической жидкости к использованию
Групповую принадлежность амниотической жидкости устанавливают путем определения групповой принадлежности крови новорожденного или методом истощения агглютининов альфа и бета в гемагглютинирующей сыворотке группы О(I). Для этого в пробирке смешивают равные объемы (по 1 мл) стандартной гемагглютинирующей сыворотки с титром 1:32 и испытуемой амниотической жидкости. Смесь перемешивают и оставляют на 10 мин. при комнатной температуре. Затем смесь сыворотки и амниотической жидкости исследуют на плоскости со стандартными эритроцитами группы А(II) и В(III). Соотношение эритроцитов и смеси должно соответствовать примерно 1:10, экспозиция 5-7 минут.
Трактовка результатов
- Наличие агглютинации в каплях с эритроцитами группы А(II) и группы В(III) указывает на отсутствие в амниотической жидкости групповых антигенов А и В, т.е. на принадлежность ее к группе О(I). Такая амниотическая жидкость не пригодна для нейтрализации групповых агглютининов.
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы А(II) и наличие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе А(II).
- Отсутствие агглютинации в капле с эритроцитами группы В(III) и наличие ее с эритроцитами группы А(II) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе В(III).
- Отсутствие агглютинации в каплях, как с эритроцитами группы А(II), так и группы В(III) указывает на принадлежность амниотической жидкости к группе АВ(IV).
Групповую принадлежность записывают на этикетке, которую наклеивают на флаконе с амниотической жидкостью.
Контроль амниотической жидкости на специфичность
Следует учитывать возможность попадания в амниотическую жидкость крови роженицы, в связи с чем необходимо исследовать каждый образец амниотической жидкости на наличие групповых агглютининов.
Исследование амниотической жидкости с эритроцитами группы А(II) и В(III) проводится аналогично определению групповой принадлежности крови.
Наличие агглютинации означает наличие в амниотической жидкости групповых агглютининов крови роженицы. Такой образец непригоден для работы.
Фильтрация и консервирование амниотической жидкости
После определения групповой принадлежности и контроля на специфичность амниотическую жидкость фильтруют через обычный бумажный фильтр или под вакуумом через фарфоровую воронку Бюхнера, в которую помещает измельченную фильтровальную бумагу толщиной 5-7 мм. После фильтрования амниотическая жидкость становится прозрачной.
Консервирование производится борной кислотой из расчета 2 гр на 100 мл или азидом натрия 1 г на 1000 мл.
Срок хранения амниотической жидкости 12 месяцев при 4-8°С.
Высушивание амниотической жидкости
С целью удлинения срока годности амниотическую жидкость высушивают по 150-250 мл во флаконах емкостью 250-500 мл. На флаконы наклеивают этикетки с указанием группы амниотической жидкости по системе АВО, ее исходного количества и даты высушивания.
Высушенную амниотическую жидкость хранят при комнатной температуре. Срок годности 5 лет. Высушенную амниотическую жидкость перед употреблением разводят дистиллированной водой до исходного объема. После растворения используют аналогично нативной.
Методические рекомендации "Удаление из сыворотки антирезус антител другой специфичности", утвержденные Министерством здравоохранения СССР 27 ноября, 1990 года N 10-11/136, считать утратившими силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 7
Инструкция
по определению резус-принадлежности крови
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
1. Введение
Определение резус-принадлежности заключается в выявлении в эритроцитах людей антигена D системы Резус.
В систему Резус входят шесть антигенов: D, d, С, с, Е, е, которые
определяют с помощью соответствующих антисывороток. Антиген d
серологически не выявляется. Существуют также разновидности антигенов
u w v x
резус: D , С , с , с и другие.
Антигены системы Резус встречаются со следующей частотой:
D - 85%
С - 70% с - 80%
Е - 30% е - 97,5%
Антигены системы Резус обладают способностью вызывать образование изоиммунных антител.
Наиболее активным в этом отношении является антиген D, который и подразумеваетcя под термином резус-фактор. Именно по наличию или отсутствию антигена D все люди делятся на резус-положительных и резус - отрицательных.
Различные сочетания антигенов резус в крови отдельных людей составляют 28 групп системы Резус (Табл.1). В четырнадцати из них содержится антиген D - они являются резус-положительными, а другие четырнадцать не содержат антигена D (нижняя часть таблицы) - их относят к резус - отрицательным.
Таблица 1
Система резус
--------T---------------------------------------------------------------¬ ¦ N ¦ Резус-положительные ¦ ¦ п/п +----------------T-----------------T--------------T-------------+ ¦ ¦ Фенотип ¦ Частота в % ¦ Генотип ¦ Частота в %¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦1-2 ¦ССDEE C CDEe ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 3 ¦ CCDEe ¦ 0,07 ¦ CDE/CDe ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 4 ¦ CcDEE ¦ 0,035 ¦ CDE/cdE ¦ 0,006 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDE/CdE ¦ 0,029 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 5 ¦ CcDEe ¦ 13,69 ¦ CDe/cDE ¦ 12,24 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ CDE/cDe ¦ 0,01 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ CDe/cdE ¦ 0,97 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDE/Cde ¦ 0,27 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ CDE/cde ¦ 0,19 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cdE ¦ 0,006 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 6 ¦ C cDEe ¦ 1,23 ¦ ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 7 ¦ ccDEe ¦ 11,82 ¦ cDE/cde ¦ 10,04 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cDe ¦ 0,72 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDe/cdE ¦ 0,06 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 8 ¦ ccDEE ¦ 2,49 ¦ cDE/cDE ¦ 2,16 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDE/cdE ¦ 0,33 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ 9 ¦ CcDee ¦ 31,93 ¦ Cde/cde ¦ 29,90 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ CDe/cDe ¦ 1,98 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDe/Cde ¦ 0,05 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦10 ¦ C cDee ¦ 2,38 ¦ ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦11 ¦ CCDee ¦ 16,81 ¦ CDe/СDe ¦ 16,01 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ СDe/СDe ¦ 0,80 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦12 ¦ C CDee ¦ 2,60 ¦ ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦13 ¦ C C De ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦14 ¦ ccDee ¦ 2,21 ¦ cDe/cde ¦ 2,10 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ cDe/cDe ¦ 0,11 ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ Резус-отрицательные ¦ +-------T----------------T-----------------T--------------T-------------+ ¦15 ¦ ccddee ¦ 12,71 ¦ cde/cde ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦16 ¦ Ccddee ¦ 1,54 ¦ Cde/cde ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦17 ¦ CCddee ¦ 0,03 ¦ Cde/Cde ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦18 ¦ C cddee ¦ 0,035 ¦ C de/cde ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦19 ¦ ccddEe ¦ 0,070 ¦ cde/cdE ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦20 ¦ CcddEe ¦ 0,35 ¦ Cde/cdE ¦ ¦ +-------+----------------+-----------------+--------------+-------------+ ¦ ¦ w w w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦21- ¦C Cddee C C ddee¦ ¦ ¦ ¦ ¦28 ¦ccddEE CcddEE ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦CCddEE CCddEe ¦ 0,00 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ w ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦CcddEe C CddEe ¦ ¦ ¦ ¦ L-------+----------------+-----------------+--------------+--------------
II. Общие замечания
1. Определение резус-принадлежности
Определение резус-принадлежности производится специалистом, имеющим специальную подготовку.
Определение резус-принадлежности реципиентов производится стандартной сывороткой анти-D, что дает возможность разделить их на резус - положительных (Rh+) и резус - отрицательных (rh-).
В отличие от реципиентов определение резус-принадлежности крови доноров производится в два этапа: сначала кровь доноров исследуется стандартной сывороткой анти-D, а затем кровь доноров, давшую отрицательную реакцию с сывороткой анти-D, исследуют дополнительно стандартными сыворотками антирезус, содержащими антитела анти-С и анти-Е. Антитела анти-С и анти-Е могут быть в сыворотке как в чистом виде, так и в сочетании с антителами анти-D, например: анти-D+С; анти-D+Е или анти-D+С+Е.
В число резус-отрицательных доноров зачисляются только лица, кровь которых дает отрицательную реакцию со всеми сыворотками, т.е, не содержит ни одного из этих трех антигенов резус D, С, Е.
Иногда такие дополнительные исследования требуется проводить и у других лиц - у больных с подозрением на изосенсибилизацию и у беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров записывается в специальных листах или журнале и на лицевом листе донорского журнала (карточке) с указанием даты и за подписью лиц, производивших определение.
Результат определения резус-принадлежности крови больных и других лиц записывается в специальный журнал и на бланке с указанием даты и за подписью лиц, производивших определение. Этот бланк вклеивается в историю болезни и, кроме того, результат, указанный на этом бланке, записывается лечащим врачом в правом верхнем углу лицевого листа истории болезни и скрепляется его подписью с указанием даты.
2. Учет групповой принадлежности сыворотки антирезус.
Сыворотки антирезус изготавливаются обычно в виде "универсальных", т.е. лишенных групповых антител анти-А и анти-В. Такие сыворотки пригодны для определения резус-принадлежности крови людей любой гhуппы по системе АВО.
Однако, если изготовляются сыворотки антирезус различных групп по системе АВО, то в этих случаях при определении резус-принадлежности необходимо учитывать специфичность сыворотки. Сывороткой антирезус группы О(I) определяется резус-принадлежность только в эритроцитах группы O(I); сывороткой антирезус группы А(II) - только в эритроцитах групп O(I) и А(II); сывороткой антирезус групп B(III) - только в эритроцитах групп O(I) и B(III); сыворотной антирезус группы АВ(IV) и специально приготовленной "универсальной" резус-принадлежность определяется в эритроцитах группы АВ(IV) и любой другой группы крови.
3. Контрольные исследования
При каждом исследовании или проводимой серии исследований необходимо для проверки специфичности и активности сыворотки антирезус ставить контроль. Для контроля применяются стандартные резус - положительные эритроциты группы О(I) или той же группы, что и исследуемая кровь, и cтандартные резус-отрицательные эритроциты.
О стандартных эритроцитах см. "Инструкцию по взятию и учету крови, получаемой от доноров малыми дозами для приготовления стандартных эритроцитов".
4. Особенности стандартных сывороток антирезус
Стандартные сыворотки для определения резус-принадлежности могут содержать резус-антитела разные по форме - полные и неполные (см."Инструкцию по исследованию сыворотки на наличие резус-антител"). Каждые из этих антител активны только в особых условиях, поэтому методика определения резус - принадлежности зависит от того, какие резус антитела находятся в стандартной сыворотке.
Метод использования каждой стандартной сыворотки антирезус указывается в сопроводительной инструкции.
III. Различные методы определения резус-принадлежности
Метод определения резус-принадлежности зависит от формы антител в стандартной сыворотке и способа ее изготовления.
При выдаче сыворотки антирезус к ней придается краткая сопроводительная инструкция с описанием того метода, для которого предназначена данная серия выдаваемой сыворотки.
1. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации с
применением желатина в пробирке с подогревом 46-48°С
а) Специальное оснащение.
Стандартная сыворотка антирезус анти-D с неполными антителами.
Стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля.
Центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл.
Водяная баня 46-48°С. Суховоздушный термостат 46-48°С
10% раствор желатина. (Желатин можно сохранять с консервантом - сульфацилом натрия (альбуцид) - из расчета 100 мг альбуцида на 10 мл 10% раствора желатина).
Лупа с 2-4-кратным увеличением.
б) Предварительная обработка испытуемой крови и стандартных эритроцитов. Кровь для исследования следует брать в количестве 5-8 мл в пробирку без стабилизатора. На пробирке надписать фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь.
Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество свободных эритроцитов, которые следует употреблять для исследования. Если этих эритроцитов недостаточно, следует встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при температуре +4-8°С.
Можно брать кровь с изотоническим раствором лимоннокислого натрия или другого стабилизатора (0,25 мл на 1 мл крови). В этом случае эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирку долить доверху изотонический раствор NаСl содержимое ее перемешать и центрифугировать. Отмытые эритроциты использовать для исследования.
Непосредственно перед исследованием кровь может быть взята из места укола пальца стеклянной палочкой и немедленно помещена в пробирку с заранее введенной сывороткой антирезус, смешанной с желатином 1:2.
в) Техника определения. В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов. На каждых двух пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться. Пробирки нумеруют. В одинаково обозначенные пробирки (в два ряда) вводят по 1 капле (0,05 мл) исследуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) стандартных Rh+ и rh- эритроцитов.
Во все пробирки первого ряда добавляют по одной капле (0,05 мл) сыворотки антирезус.
Во все пробирки (в два ряда) добавляют по две капли (0,1 мл) 10% раствора желатина, предварительно подогретого до разжижения.
Второй ряд является контролем для исключения возможного неспецифического склеивания исследуемых эритроцитов (прямая желатиновая проба).
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и штатив с пробирками помешают в водяную баню при 46-48°С на 15 минут или в суховоздушный термостат на 25-30 минут.
При извлечении пробирок из водяной бани или термостата доливают в них 5-8 мл изотонического раствора NаСl и перемешивают содержимое путем 1-2-кратного перевертывания пробирок.
г) Трактовка результатов. Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы в виде красных комочков в прозрачной, почти обесцвеченной жидкости.
При отрицательном результате в пробирке видна равномерно окрашенная в светло-красный цвет, опалесцирующая жидкость.
Резус-положительная Резус-отрицательная
Рисунок 1. Результат реакции определения резус-принадлежности методом с применением желатина.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+). Образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-). Однако результаты учитывают как истинные после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус - положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I). В пробирках второго (контрольного) ряда агглютинации быть не должно.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда (прямая желатиновая проба положительная) говорит о неспецифичности реакции. При этих условиях положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный. В таких случаях рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител и повторить исследование. При сомнительном результате для определения резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в солевой среде с использованием сывороток антирезус, содержащих полные антитела.
2. Определение резус-принадлежности при помощи стандартного
универсального реагента (в пробирках без подогрева)
Специальное оснащение.
стандартный универсальный реагент антирезус - анти-D;
33% раствор полиглюкина;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
центрифужные или другие пробирки вместимостью 10 мл;
лупа с 2-4-кратным увеличением.
Предварительная обработка исследуемой крови не требуется. Может быть использована кровь, взятая непосредственно перед исследованием из места укола пальца, консервированная кровь и осадок эритроцитов в пробирке, после образования свертка крови, взятой без стабилизатора.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника реакции.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждой ряду и по две пробирки для стандартных резус-положительных и резус - отрицательных эритроцитов. На пробирках надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется.
Во все пробирки первого ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) стандартного универсального реагента антирезус.
Во все пробирки второго (контрольного) ряда вводят по 2 капли (0,1 мл) изотонического раствора NаСl и по 1 капле (0,05 мл) 33% раствора полиглюкина.
В каждую пару одинаково обозначенных пробирок вводят согласно маркировке по 1 капле (0,05 мл) исследуемой крови. В пробирки, предназначенные для контроля, вводят стандартные резус-положительные и резус - отрицательные эритроциты.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием и затем медленно поворачивают по оси, наклоняя почти до горизонтального положения так, чтобы содержимое растекалось по ее стенкам. Такое растекание крови по стенкам пробирок делает реакцию более выраженной. Как правило, агглютинация наступает уже в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной реакции, а также в виду возможности замедленной реакции при слабо выраженной агглютинабельности эритроцитов, контакт эритроцитов с реагентом при поворачивании пробирок проводят не менее 3 мин.
Через 3 минуты в пробирки добавляют по 2-3 мл изотонического 0,85% раствора NаСl и перемешивают содержимое 2-3-кратным перевертыванием пробирок, не встряхивая.
Трактовка результатов
Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом или через лупу. Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При наличии агглютинации в виде крупных комочков или хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости исследуемую кровь считают резус-положительной (Rh+). При отсутствии агглютинации (в пробирке сохраняется гомогенное окрашивание) исследуемую кровь следует считать резус-отрицательной (rh-). Однако эти результаты следует учитывать как истинные только после проверки контрольных образцов, т.е. при положительной реакции со стандартными резус-положительными эритроцитами, отрицательной - с резус-отрицательными, а также после просмотра результатов во 2-ом контрольном ряду.
Во всех пробирках 2-го контрольного ряда агглютинации быть не должно.
Резус-положительная Резус-отрицательная
Рисунок 2. Результат определения резус-принадлежности с помощью реагента.
Наличие агглютинации в какой-либо пробирке контрольного ряда указывает на неспецифическое склеивание эритроцитов и, следовательно, не позволяет учесть результат исследования как истинный.
В этом случае рекомендуется отмыть исследуемые эритроциты теплым изотоническим раствором NаСl для элюирования с них аутоантител и повторить исследование.
В сомнительных случаях для определения резус-принадлежности следует применить метод агглютинации в солевой среде, используя сыворотку с полными антителами.
3. Определение резус-принадлежности реакцией конглютинации в
сывороточной среде на плоскости с подогревом
Специальное оснащение:
стандартные сыворотки антирезус анти-D с неполными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пластмассовые пластины;
водяная баня 46-48°С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 3-5 мл в обычные пробирки без стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого берется кровь. Обычно после свертывания крови на дне пробирки остается небольшое количество эритроцитов, которые следует употреблять для реакции. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встрянуть сверток для отделения большего количества эритроцитов.
Эритроциты используют для исследования в виде 5-10% взвеси в собственной сыворотке. Взвесь готовят на глаз в этих же пробирках путем встряхивания содержимого.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника определения.
На пластмассовую пластину у обозначений наносят по 1 большой капле (0,1 мл) сыворотки антирезус в три ряда по горизонтали, всего в 6 точек (3 - одной серии сывороток и 3 - другой). Кроме того, в одну точку наносят большую каплю (0,1 мл) стандартной сыворотки группы АВ(IV), не содержашей резус-антител (контроль на неспецифическую агглютинацию).
К первой капле каждой серии сыворотки добавляют одну каплю (0,05 мл) взвеси исследуемых эритроцитов, ко второй капле каждой серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-положительных, одноименных с группой крови больного или группы O(I), и к третьей капле каждой серии - 1 каплю (0,05 мл) контрольных резус-отрицательных эритроцитов, обязательно одноименных с группой крови больного по системе АВО. В контрольную каплю с сывороткой группы АВ(IV), не содержащей резус-антител добавляют 1 каплю (0,05 мл) исследуемых эритроцитов. Капли перемешивают стеклянной палочкой и пластину опускают в водяную баню при 46-48°С на 10 минут.
Трактовка результатов.
Результаты исследований просматривают при легком покачивании пластины и трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов.
При положительном результате агглютинаты легко различимы на почти обесцвеченном фоне жидкости.
При отрицательном результате капля остается равномерно окрашенной в красный цвет.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+).
Образцы эритроцитов, не давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-отрицательными (rh-). Однако, эти результаты учитывают как истинные только при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов эритроцитов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I), а также при отрицательном результате в контрольной капле с сывороткой группы АВ(IV), не содержащей резус-антител. Наличие агглютинации в этой капле говорит о неспецифическом склеивании эритроцитов и, следовательно, положительный результат с сывороткой антирезус не может быть учтен как истинный. В этих случаях резус-принадлежность следует определять, применяя другие методы исследования.
4. Определение резус-принадлежности реакцией
агглютинации в солевой среде
Специальное оснащение.
стандартные сыворотки антирезус анти-D с полными антителами;
стандартные эритроциты Rh+ и rh- для контроля;
пробирки высотой 1,5-2,0 см и диаметром 0,5-0,6 cм с гладким дном округлой формы или планшеты для иммунологических реакций с углублениями такой же конфигурации и объема;
лупа с 2-4-кратным увеличением;
термостат 37°С.
Предварительная обработка исследуемой крови и стандартных эритроцитов.
Кровь для исследования берут в количестве 0,5-1 мл в обычные пробирки, содержащие 0,25 мл (5 капель) изотонического раствора лимоннокислого натрия или другого стабилизатора. На пробирке надписывают фамилию, инициалы и группу крови лица, от которого взята кровь. Эритроциты необходимо отмыть, для чего в пробирки доливают доверху изотонический раствор NаСl, содержимое их перемешивают и центрифугируют.
Можно брать кровь без стабилизатора. При этом после свертывания крови обычно в пробирке остается некоторое количество свободных эритроцитов. Если этих эритроцитов недостаточно, следует интенсивно встряхнуть сверток для отделения большего количества эритроцитов. Полученные таким образом эритроциты отмывают как сказано выше.
Из отмытых эритроцитов приготавливают 2% взвесь, для чего 1 каплю эритроцитов переносят в соответственно обозначенную пробирку, содержащую 49 капель изотонического раствора NаСl.
2% взвесь эритроцитов употребляют для исследования.
Допустимо хранить кровь в течение 2-3 суток при 4-8°С.
Техника определения.
В штатив устанавливают два ряда пробирок по числу исследуемых образцов эритроцитов в каждом ряду и две - для контролей. Предварительно штатив накрывают листом бумаги. На нем слегка накалывают отверстия, сквозь которые и устанавливают пробирки. Против каждой пары пробирок на бумаге надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого будет исследоваться.
Во все пробирки (лунки планшета) первого ряда вводят по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус одной серии, во все пробирки (лунки) второго ряда - по 1 капле (0,05 мл) сыворотки антирезус другой серии и во все пробирки (лунки) обоих рядов по 1 капле изотонического раствора NаСl.
В соответственно обозначенные пары пробирок (лунок планшета) добавляют по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси испытуемых эритроцитов, а в контрольные - по одной капле (0,05 мл) 2% взвеси контрольных (стандартных) резус-положительных и резус-отрицательных эритроцитов.
Содержимое тщательно перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при 37°С на 1 час. Можно затем оставить пробирки на столе при комнатной температуре еще на 1,5-2 часа до учета результата.
За это время эритроциты оседают на дно, предварительно войдя в контакт с сывороткой антирезус.
Трактовка результатов.
Пробирки (планшеты) следует рассматривать по продольной оси над источником света, закрытым матовым стеклом.
Результат трактуют по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов, что выражается в разной форме их осадка на дне.
При положительном результате осадок эритроцитов располагается на дне неравномерным слоем. Видна шероховатость, губчатость или зернистость его структуры. Края осадка никогда не бывают ровными, они изогнуты, иногда завернуты внутрь. В некоторых случаях эритроциты располагаются в виде волнистого венчика вокруг более светлой центральной части.
При отрицательном результате осадок эритроцитов располагается равномерным слоем без шероховатостей и неровностей, иногда с небольшим просветлением в центре. Границы его представляют собой правильно очерченный круг.
Диаметр осадка при отрицательном результате всегда меньше, чем при положительном.
Образцы эритроцитов, давшие агглютинацию с сывороткой анти-D, являются резус-положительными (Rh+), образцы эритроцитов, не давшие агглютинации с сывороткой анти-D - резус-отрицательными (rh-).
Рисунок 4. Определение резус-принадлежности в солевой среде.
Резус-положительная. Резус-отрицательная.
Рисунок 5. Осадок эритроцитов при определении резус-принадлежности в солевой среде.
Однако результаты учитывают как истинные при совпадении их в обеих сериях сыворотки антирезус и после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус - положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I).
u
Примечание. Полные антитела не выявляют слабый антиген D .
Повторное использование сыворотки. После определения резус-принадлежности из всех пробирок осторожно отсасывают сыворотку (эритроциты остаются на дне) и собирают ее в пробирку. Эту сыворотку можно повторно несколько раз применять для определения резус-принадлежности, пока активность ее не иссякнет, т.е. пока она будет давать четкую агглютинацию со стандартными резус-положительными эритроцитами и отрицательную реакцию - со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
IV. Общие примечания
1. При определении резус-принадлежности независимо от метода определения результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, подтверждающих специфичность и активность каждой серии сыворотки антирезус, т.е. при отсутствии агглютинации со стандартными резус - отрицательными эритроцитами одноименной группы и наличии агглютинации со стандартными резус-положительными эритроцитами одноименной группы или группы О(I) и в других контрольных пробах, применяемых для каждого метода.
2. Если при определении резус-принадлежности наблюдается слабая или сомнительная реакция, то следует повторно исследовать кровь данного лица другими сериями сывороток антирезус и другими методами, включая метод агглютинации в солевой среде с сыворотками, содержащими полные антитела.
Если при этом все серии сывороток, содержащих неполные антитела,
дадут также слабую или сомнительную реакцию, а с полными антителами
реакция будет отрицательная, это значит, что эритроциты содержат слабую
u
разновидность антигена резус, так называемый антиген D , частота
которого около 1%. В этих случаях резус-принадлежность крови больного
или беременной женщины указывают как резус-отрицательную (rh-), а резус
- принадлежность крови донора как резус-положительную (Rh+), не допуская,
таким образом, переливания его крови резус-отрицательным реципиентам.
V. Исследование других антигенов системы резус
При использовании сывороток, содержащих антитела анти-С, анти-Е,
w
анти-с, анти-е, анти-С в чистом виде, а также в сочетании с анти-D,
например D+С; D+Е; D+С+Е, применяются те же методы, что и при
использовании сыворотки антирезус анти-D. При этом учитывается форма
антител.
В качестве контролей используют эритроциты, содержащие и не содержащие соответствующий антиген.
"Инструкцию по определению резус-принадлежности крови", утвержденную Министерством здравоохранения СССР 7 сентября 1990 года N 05-14/29, считать утратившей силу с момента утверждения данной инструкции.
Начальник Управления
организации медицинской
помощи населению
А.И.Вялков
Приложение 8
Инструкция
по определению резус-принадлежности крови на плоскости без подогрева
и по изготовлению стандартной сыворотки и реактива антирезус,
предназначенных для этой цели
(утв. приказом Минздрава РФ от 9 января 1998 г. N 2)
Общие сведения
Методы определении резус-принадлежности на плоскости без подогрева позволяют быстро проводить исследование без применения особого лабораторного оборудования непосредственно у постели больного, а также у доноров как в единичных случаях, так и при массовых обследованиях.
Методы основаны на использовании сывороток антирезус, изготовленных в сочетании с коллоидными растворами (альбумин, полиглюкин), в присутствии которых неполные резус-антитела приобретают способность агглютинировать резус-положительные эритроциты на плоскости при комнатной температуре, аналогично реакции по определению групп крови АВО.
Наиболее удобными для практики являются методы определения на плоскости без подогрева, при помощи сыворотки антирезус, изготовленной в сочетании с альбумином и при помощи реактива антирезус, изготовленного из сыворотки антирезус в сочетании с сухим полиглюкином и альбумином.
1. Определение резус-принадлежности на плоскости без подогрева при
помощи сыворотки антирезус, приготовленной с альбумином
(прилагается при выдаче сыворотки)
Оснащение:
а) специально приготовленная универсальная сыворотка антирезус анти-D в комплекте с контрольной сывороткой;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NaCl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола или взятую заранее в пробирку со стабилизатором, но не более 2 суток хранения при 4-8°С.
Техника реакции
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующее обозначение, наносят на нее в две точки: слева по 2 капли сыворотки антирезус и справа по 2 капли контрольной сыворотки. Рядом с этими каплями наносят по 1 капле исследуемой крови. Кровь тщательно смешивают с сывороткой стеклянной палочкой и размазывают на пластинке до получения тонкого слоя. Затем пластинку периодически покачивают в течение 4-5 минут и добавляют в обе смеси по 1 капле изотонического раствора NaCl для снятия возможной неспецифической агглютинации. Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, то есть с сывороткой антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (контроль) ее нет- кровь остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации, это значит, что исследуемая кровь резус-положительная (Rh+).
Если в обеих каплях агглютинация отсутсвует, это значит, что исследуемая кровь резус-отрицательная (rh-).
При наличии агглютинации в контрольной капле, что может произойти при некоторых заболеваниях, например, за счет аутоантител, необходимо исследовать кровь повторно другими методами, желательно в лабораторных условиях.
2. Определение резус-принадлежности при помощи реактива антирезус,
изготовленного с использованием сухого полиглюкина
(прилагается при выдаче реактива)
Оснащение:
а) специально приготовленный реактив антирезус анти-D в комплекте с контрольным реактивом;
б) белая пластинка со смачиваемой поверхностью;
в) изотонический раствор NаСl;
г) стеклянные палочки.
Для исследования используют кровь, полученную непосредственно из места укола пальца или взятую заранее в пробирку со стабилизатором не более чем за 2 суток до исследования. Кровь хранят при 4-8°С.
Техника реакции
На пластинке надписывают фамилию и инициалы лица, кровь которого исследуется и, сделав соответствующие обозначения, наносят на нее слева 1 каплю реактива анти-резус и справа - 1 каплю контрольного реактива, затем добавляют и к реактиву антирезус, и к контрольному реактиву по 1 капле густой взвеси исследуемой крови.
Кровь тщательно смешивают с реактивом и размазывают по пластинке стеклянной палочкой тонким слоем. Затем пластинку периодически покачивают в течение 3-4 минут и добавляют в обе смеси для исключения неспецифической агглютинации по 5-8 капель изотонического раствора NаСl.
Наблюдение за ходом реакции продолжают до истечения 5 минут, после чего учитывают результат.
Трактовка результата.
Если слева, т.е. с реактивом антирезус, произошла агглютинация эритроцитов, а справа (в контроле) ее нет - это значит, что исследуемая кровь резус - положительная (Rh+).
Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6